2.9: 质粒纯化

质粒是环状、染色体外的 DNA 分子，在分子生物学中，它们充当特定 DNA 片段的载体或载体。细菌用于复制质粒，以便大规模生产您感兴趣的 DNA。研究人员从细菌中获得质粒的过程称为质粒纯化，本视频将对此进行解释。

显然，质粒纯化涉及纯化质粒，但这究竟意味着什么？为了纯化质粒，必须从细菌染色体、蛋白质、细菌膜和细菌核糖体中分离出质粒。

尽管存在许多不同的试剂盒用于纯化质粒，但质粒纯化背后的基本原理对所有试剂盒都是相同的。首先，将选定的细菌菌落在含有正确抗生素的适当培养基中生长。由于质粒编码的抗生素抗性基因，只有含有质粒的细菌才会在该培养基中生长。在高 pH 值下收获和裂解细菌。中和 pH 值，加入盐，然后离心混合物以去除碎片和基因组 DNA。

将中和的细胞裂解物添加到硅胶柱上。 质粒 DNA 被认为通过一种称为阴离子交换的机制粘附在色谱柱上，其中 DNA（一种强阴离子）通过阳离子盐桥与带负电荷的色谱柱结合。裂解物中的其他物质（如蛋白质）用高盐缓冲液通过色谱柱洗涤。最后，当加入低盐缓冲液破坏盐桥时，纯化的质粒从色谱柱中释放出来。

对于此过程，应穿着实验室外套、一次性手套和护目镜。

用所需质粒 DNA 转化的细菌培养物应在含有适当抗生素的生长培养基中以 37？C 振荡培养箱。

第二天，通过离心沉淀细菌培养物并除去上清液。将剩余的沉淀重悬于裂解缓冲液中。

重悬后，可以将细菌转移到加入裂解缓冲液的较小试管中。裂解缓冲液具有高 pH 值，并含有去污剂，如十二烷基硫酸钠，这些去污剂会破坏细菌膜，从而裂解细菌。 加入裂解缓冲液后，溶液会变得浑浊，混合后溶液变得更加透明。混合物不应涡旋混合，因为可能会剪切或分解基因组 DNA，从而污染质粒 DNA 纯化。

然后，加入中和缓冲液以中和碱性条件并降低 pH 值。轻轻混合后，基因组 DNA 以及与其结合的任何蛋白质都会沉淀，而质粒 DNA 将保持溶液状态。再次避免涡旋，以确保您的质粒不受基因组 DNA 污染。

然后将混合物离心并沉淀基因组 DNA/蛋白质沉淀物。上清液包含质粒 DNA 以及可溶性蛋白质。

该上清液通过倾析（倾析或移液的花哨名称）置于色谱柱上。 颗粒可以丢弃。

接下来，高盐洗涤缓冲液通过色谱柱，而 DNA 仍与硅胶膜结合。使用高盐缓冲液重复洗涤步骤可去除核酸内切酶、RNA、蛋白质、染料和低分子量杂质。应丢弃洗涤步骤的流出物。在最后的洗涤步骤之后，确保过滤器完全干燥，没有任何缓冲液残留。质粒 DNA 仍然位于过滤器上。

质粒 DNA 用无菌水或洗脱缓冲液洗脱。DNA 可立即用于广泛的应用。

有多种方法可以验证纯化后质粒的纯度。光谱仪可用于比较不同波长下的吸光度，以确定质粒 DNA 的浓度。对纯化质粒进行琼脂糖凝胶分析可以确定质粒大小是否正确且没有污染物。该步骤可确保没有基因组 DNA 污染，并且质粒未在细菌中被修饰。

质粒纯化程序可以修改以适应不同的质粒大小、拷贝数、培养体积，并且可以包括用于结合、洗涤和洗脱步骤的不同设备。产量恰好是质粒制备之间最突出的区别之一，它们通常根据所需的产量分为小量制备或小量制备、中量制备、大量制备和大量制备。

在下游应用方面，质粒纯化之后通常采用的一个程序是转染，这涉及将质粒 DNA 引入真核细胞中。转染实验的目标通常是使用报告蛋白可视化细胞和组织的结构，例如您在此处看到的图像中标记神经元的细胞和组织。

有时，通过多种纯化制备物纯化的多个质粒可以引入同一细菌中，从而通过产生由质粒编码的多种酶来复制整个生物合成途径。最终结果是细胞制造一种复杂的化合物，就像你在这里看到的抗生素一样。

纯化的质粒可以重新引入细菌中，以产生大量由质粒编码的蛋白质。在这里，您可以看到细菌细胞被匀浆和裂解，然后才能进行一种称为亲和纯化的技术来分离靶蛋白。 纯化的蛋白质结晶，然后鉴定其结构。

您刚刚观看了 JoVE 对质粒纯化的介绍。在本视频中，我们讨论了该方法背后的基本原理、分步描述以及质粒制备的一些应用。一如既往，感谢您的观看！