用于研究功能、相互作用及翻译后修饰的芽殖酵母蛋白质提取与纯化

本实验的总体目标是在保持蛋白质天然结构、功能相互作用及翻译后修饰的前提下，从酵母中提取目标蛋白。首先通过培养细胞以诱导目标蛋白的表达，随后将收获的酵母细胞在适当的缓冲液中进行匀浆，从而实现蛋白质的提取。

然后使用亲和树脂从澄清的全细胞提取物中纯化目标蛋白。该实验步骤的最后一步是从亲和树脂中洗脱纯化后的蛋白，以用于后续分析或下游应用。最终可通过Western印迹分析获得结果，用以显示蛋白纯化过程中的修饰及其相互作用情况。

演示该实验步骤的是伊娃·基（Eva Ky），她是威廉与玛丽学院的毕业生，在过去的几年中作为本科研究员在我实验室工作。与现有其他方法相比，珠磨法的主要优势在于能够在保持蛋白质功能、相互作用及翻译后修饰的前提下，快速处理并裂解多个样品。首先，将编码半乳糖诱导型六组氨酸标签目标蛋白的质粒转化至gal阳性酵母菌株中，将转化子接种于5毫升含有2%蔗糖的适当选择性培养基（如SD-尿嘧啶培养基）中，30°C、振荡条件下过夜培养。次日，将过夜培养物按适当比例稀释至含2%蔗糖的选择性培养基中，终体积为33毫升，使600纳米处的光密度值（OD600）为0.3，在30°C、150 rpm振荡培养箱中继续培养。

当培养物的 OD 600 达到 0.8 至 1.5 时，通过加入 17 毫升含 6% 半乳糖的三倍 XYEP 培养基，诱导目标蛋白的表达，使终浓度为含 2% 半乳糖的一倍 XYEP 培养基，并在 30 °C 摇床培养箱中继续培养 5 至 6 小时。测定诱导后培养物的 OD 600 后，于 4 °C、5,000 RPM 条件下离心约 150 至 200 OD 600 单位的细胞 5 分钟，然后加入 1 毫升预冷的含一倍蛋白酶抑制剂混合液的一倍 XPBS 重悬细胞沉淀，并转移至 2 毫升螺口管中，在 4 °C、15,000 RPM 条件下离心 1 分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀在液氮中迅速冷冻，保存冷冻的细胞沉淀。

加入 200 微升酸洗玻璃珠和 500 微升冰上预冷的裂解缓冲液。始终将离心管保持在冰上。使用剪去末端的移液枪头，在 4 摄氏度下轻轻吹打数次。

将细胞管放入珠磨机配平锁中，按照制造商的说明以每秒5.5米的速度运行20秒。然后将管子置于冰泥中静置1分钟。重复上述步骤共六次，以充分裂解细胞并释放蛋白质，随后在4°C下以15,000 RPM离心15分钟，分离提取的蛋白质。

然后，为进行蛋白质印迹（western blot）分析，制备全细胞提取物（WCE）样品：取相当于2个OD 600单位细胞的WCE，加入800微升20%三氯乙酸（TCA），涡旋混匀。为纯化样品，取50至100微升亲和树脂加入新的微量离心管中，加入1毫升洗涤缓冲液，通过反复倒置使树脂重悬，以洗涤并平衡树脂。在5,000 ×g、4°C条件下离心1分钟，吸弃上清液。随后，将100至200微升澄清的裂解液加入已洗涤的树脂珠中，并用裂解缓冲液将总体积调至1毫升，以进行亲和纯化结合蛋白。

在4°C下，将样品与突变体共孵育或摇动2至5小时。将剩余的澄清WCE分装后，用液氮速冻，并在-80°C下保存以备后续使用；同时，将裂解液beet溶液在冰上孵育用于WCE蛋白免疫印迹样品。在4°C、15,000 RPM条件下离心2.5分钟，小心倾倒上清液并保留沉淀，向沉淀中加入800 µL的2% TCA，涡旋混匀后，重复2.5分钟的离心步骤。

小心倾去上清液后，加入100微升TCA样品缓冲液，涡旋震荡以溶解沉淀，随后将样品进行孵育。在100摄氏度的加热块中加热2至5分钟，再次处理以充分溶解可能残留的沉淀物（沉淀物可能较难溶解），然后于-80摄氏度保存，直至使用。待裂解珠样品孵育完成后，于4摄氏度、5,000转/分钟离心1分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤树脂5次，以洗脱蛋白质。

在4°C下向树脂中加入150 µL洗脱缓冲液，孵育5分钟。在5,000 ×g及4°C条件下离心1分钟，将上清液收集至新的离心管中。最后，向25 µL未稀释的蛋白样品中加入25 µL 2× 氯化锂十二烷基硫酸盐上样缓冲液和2 µL BME，混匀以制备用于Western blot的样品。

如图所示，可以从酵母细胞中可重复地提取多种蛋白质。在不同分子量范围内出现的清晰条带表明蛋白质提取物质量较高。可通过针对特定表位标签蛋白的蛋白质印迹法（western blotting）进一步验证提取物的质量。

以下是半乳糖过表达的V型标记Sumo连接酶的一个代表性结果，该蛋白的迁移位置约为120千道尔顿。通常情况下，部分降解的蛋白会在预期分子量下方呈现为多条片段条带，但在此仅观察到全长蛋白。此外，特定蛋白出现高分子量条带可能提示存在翻译后修饰。

例如，此处可以看到乳糖过表达的 SUMO 相关蛋白 S1-Δ440 和全长 SIS1。如该 Western 印迹所示，这些修饰也可在内源性表达的 S1 蛋白上得以保留。该图显示，两种核富集蛋白 SLX5 和 CS1-Δ440 已从我们的 ws 样品中成功纯化。

值得注意的是，六聚组氨酸标签蛋白可以从 W'S 中通过亲和层析纯化，且该过程在天然和变性条件下均可进行。相比之下，SLX 5G ST 和 CS one delta four 40 ha 缺乏六聚组氨酸表位，但在天然条件下仍能以对巯基敏感的方式与金属亲和树脂发生相互作用。我们提出，CIS one 以及在较小程度上 SLX five 能够通过其金属结合的环结构域与金属亲和树脂结合。

据我们所知，尽管这一特定现象尚未见报道，但已有类似情况被描述：霍乱毒素 B 亚基可通过其天然的组胺酸残基介导，结合 Nicola 亲和树脂。该观察结果提示，WCER 中的蛋白质至少部分以天然折叠状态存在，可用于蛋白质功能研究。重要的是要证明蛋白质复合物在全细胞提取物中保持完整。

代表性数据表明，在 WS cis one 中存在 CS one delta four 40、SLX five 以及作为细胞质蛋白且用作上样对照的 P GK one a。Delta four 40 利用其与金属亲和树脂结合的固有特性，从这些提取物中被纯化出来。此外，当 SLX five 与 SIS one 在酵母细胞中共表达时，EITs 中 SLX five 的水平升高，提示 SLX five 可能与 SIS one 存在相互作用。

观看本视频后，您应能够充分理解如何培养和处理酵母细胞，以便在天然条件下提取、纯化并观察酵母蛋白。