芽殖酵母蛋白质的提取和纯化功能研究，交互和翻译后修饰

该程序的总体目标是提取酵母蛋白，同时保留天然结构、功能相互作用和翻译后修饰。这是通过首先生长细胞以诱导目标蛋白的表达来实现的。接下来，将收获的酵母细胞在合适的缓冲液中匀浆以提取蛋白质。

然后，使用树脂的亲和力从澄清的全细胞提取物中纯化目标蛋白质。该程序的最后一步是从亲和填料中分离纯化的蛋白质，用于进一步分析或下游应用。最终，可以获得基于 western blot 分析的显示蛋白质纯化修饰和相互作用的结果。

演示该程序的是 Eva 的 Ky，她是 William and Mary 的毕业生，过去几年在我的实验室担任本科研究员。与其他现有方法相比，微珠串珠的主要优点是在保留蛋白质功能相互作用和翻译后修饰的条件下快速处理和裂解多个样品。为了开始用编码半乳糖诱导型 6 的质粒转化 gal 阳性酵母菌株的细胞，他选择的标记蛋白将转化体接种在 5 毫升含有 2% 蔗糖的适当选择性培养基中，例如 SD 尿嘧啶，并在 30 摄氏度下孵育过夜，第二天旋转，在含有 2% 蔗糖的选择性培养基中稀释过夜培养物，最终体积为 33 毫升，使光密度为 600纳米尺寸为 0.3，在 30 摄氏度和 150 RPM 的摇动培养箱中生长。

当培养物达到 0.8 至 1.5 的 OD 600 时，加入 17 毫升含 6% 半乳糖的 3 个 XYEP，使最终浓度为 1 个 XYEP 和 2% 半乳糖，置于 30 摄氏度的振荡培养箱中再放置 5 至 6 小时，以诱导所需蛋白质的表达。在诱导培养离心机中以 5， 000 RPM 在 4 摄氏度下以 5， 000 RPM 测量约 150 至 200 个 OD 600 单位细胞的 OD 600 后，然后使用 1 毫升冰冷的 1 个 XPBS 和 1 个 x 蛋白酶抑制剂混合物重新悬浮细胞上颚并将其转移到 2 毫升螺旋盖管中，在 15 下将细胞离心 1 分钟， 000 RPM 和 4 摄氏度。倾析上清液后，将细胞沉淀在液氮中冷冻至冷冻细胞沉淀中。

加入 200 μL 酸洗玻璃珠和 500 μL 冰冷裂解缓冲液。始终将管子放在冰上。使用带有末端截止口的移液器吸头在 4 摄氏度下短暂上下移液。

将细胞管放入珠磨机平衡锁中，并按照制造商的说明以每秒 5.5 米的速度运行机器 20 秒。然后将试管放在泥冰上 1 分钟。重复总共 6 次以清除提取的蛋白质，在 4 摄氏度下以 15， 000 RPM 离心 15 分钟。

然后制备全细胞提取物或 WCE 样品，用于蛋白质印迹和 WCE，对应于两个 OD 600 单位的细胞与 800 微升 20% 三氯乙酸或 TCA 涡旋混合。要将 50 至 100 μL 亲和填料的透明 WCE 样品纯化到新的微量离心管中，请加入 1 mL 洗涤缓冲液洗涤并平衡树脂，并上下颠倒，直到树脂重悬。在 5， 000 RPM 和 4 摄氏度下旋转 1 分钟后，吸出上清液以结合蛋白质，以 100 至 200 微升澄清的裂解物对洗涤的珠子进行亲和纯化，并使用裂解缓冲液使总体积达到 1 毫升。

在突变或四摄氏度下摇动孵育 2 到 5 小时。使用液氮快速冷冻剩余的透明 WCE 等分试样，并储存在零下 80 摄氏度直至进一步使用，同时裂解液甜菜溶液在冰上孵育 WCE 蛋白质印迹样品。在 4 摄氏度下以 15， 000 RPM 的速度旋转两分半钟后，倒出上清液，注意保留沉淀，向沉淀中加入 800 微升 2% TCA，涡旋试管，然后重复两分半钟的旋转。

小心倾析上清液后，加入 100 μL TCA 样品缓冲液并涡旋溶解沉淀，然后孵育样品。在 100 摄氏度的加热块中加热 2 到 5 分钟，需要第二次才能完全溶解颗粒的任何残留物，这些颗粒很难溶解并储存在零下 80 摄氏度，直到准备好使用。孵育裂解物珠样品后，在 5， 000 RPM 和 4 摄氏度下旋转 1 分钟后，使用洗涤缓冲液洗涤树脂 5 次以洗脱蛋白质。

在 4 摄氏度下向树脂中加入 150 μL 洗脱缓冲液，反应时间为 5 分钟。以 5， 000 RPM 和 4 摄氏度离心 1 分钟，并将上清液保存在新试管中。最后，在 25 微升 2 x 硫酸钠锂样品缓冲液中制备用于蛋白质印迹的样品，其中含有 2 微升 BME 至 25 微升 UD 蛋白样品。

如图所示，可以从酵母细胞中可重现地提取多种蛋白质。分子量范围内的离散条带表示高质量的蛋白质提取物。提取物的质量可以通过对特定表位标记蛋白的蛋白质进行蛋白质印迹来确认。

这是半乳糖过表达 V 5 标记的 Sumo 连接酶的代表性结果，是一种以约 120 道尔顿的速度迁移的酶。通常，部分降解的蛋白质会以低于预期重量的多个片段运行，但这里仅观察到全长蛋白质。此外，给定蛋白质的高分子量添加可能表明翻译后修饰。

例如，在这里你可以看到乳糖超过表达的相扑相关 S 1、delta 44 和全长 SIS 1。如本 Western 印迹所示，修饰也可以保留在内源性表达的 S 1 上。该图显示，从我们的 ws中成功纯化了两种富含核的蛋白 SLX 5 和 CS one delta four 40。

值得注意的是，在天然和变性条件下，都可以从 W'S 亲和纯化 6 个 hiss 标记的蛋白质。相比之下，SLX 5G ST 和 CS one delta four 40 ha 缺乏 six hiss 表位，但在天然条件下仍以 ole 敏感方式与金属亲和树脂相互作用。我们建议 CIS 1 和较小程度的 SLX 5 能够通过其金属配位环结构域结合金属亲和树脂。

虽然据我们所知，这种特殊现象尚未被报道，但已经描述了类似的情况，其中胆汁毒素 B 亚基以其天然组胺残基介导的方式结合 Nicola 亲和树脂。这一观察结果表明，WCER 中的蛋白质至少部分是天然折叠的，用于蛋白质功能的研究。重要的是要证明蛋白质复合物在全细胞提取物中保持完整。

代表性数据显示，CS one delta 40 SLX 5 和 P GK one 是一种用作上样对照的胞质蛋白，存在于 WS 顺式 1 中。Delta four 40 基于其与金属亲和树脂结合的固有能力从这些提取物中纯化。此外，当 SLX 5 和 SIS one 在酵母细胞中共表达时，EIT 中的 SLX 5 水平增加，增加了 SLX 5 与 SIS one 相互作用的可能性。

观看本视频后，您应该对如何生长和处理酵母细胞有很好的了解，以便在天然条件下提取、纯化和可视化酵母蛋白。