3.12: 线虫RNA干扰的简介

RNA 干扰 （RNAi） 是一种广泛使用的技术，其中双链 RNA 被引入生物体，导致靶向基因沉默。 获得诺贝尔奖的 RNA 干扰发现使研究人员能够沉默任何秀丽隐杆线虫基因，以确定其功能。 我们可以通过首先用表达靶基因 dsRNA 的大肠杆菌制备板来诱导秀丽隐杆线虫中的 RNAi，蠕虫会吃掉这些 dsRNA。然后，将第 4 幼虫阶段的蠕虫转移到 RNAi 板并让其产卵。 在所需的发育阶段，收集后代并进行表型评分。

RNAi 技术经常用于秀丽隐杆线虫进行反向遗传筛选、自动化高通量筛选，并作为研究发育过程的工具。在本视频中，我们将解释 RNA 干扰的概念，演示如何在秀丽隐杆线虫中使用 RNAi 技术，并讨论科学家如何使用 RNAi 作为工具来更好地了解广泛的生物过程。

让我们首先向您展示 RNA 干扰是如何工作的。在秀丽隐杆线虫的情况下，蠕虫被喂食细菌，这些细菌已经被编码双链 RNA 的质粒转化，这些质粒与您想要沉默的基因互补。 如前所述，秀丽隐杆线虫将以转化的细菌为食。 通过目前未知的机制，dsRNA 一旦被摄入就会进入秀丽隐杆线虫组织。

一旦进入细胞，Dicer 酶就会将双链 RNA 切割成短干扰 RNA，即 siRNA，长度在 21 到 23 个核苷酸之间。接下来，siRNA 与 RNA 诱导的沉默复合物（也称为"RISC"）结合，并解开。然后，siRNA/RISC 复合物通过互补碱基配对结合靶标 mRNA。这会导致 mRNA 降解，从而敲低该基因。

在开始作之前，需要制备表达目标双链 RNA 的细菌。 含有数千个基因的 dsRNA 编码质粒的细菌文库是市售的。 否则，需要使用标准克隆技术将目标基因序列克隆到质粒中。质粒包含对抗生素氨苄青霉素的抗性基因，可用于选择含有该质粒的细菌菌落。

接下来，使用标准技术将编码目标 dsRNA 的质粒转化为表达双链 RNA 的大肠杆菌 （DE3） 菌株。此外，用空质粒作为对照转化细菌。 重要的是，这些实验中使用的大肠杆菌菌株缺乏 RNA 聚合酶 III，否则它会消化双链 RNA。 这种细菌还包含一个 T7 DNA 聚合酶的 IPTG 诱导基因，该聚合酶转录质粒中的 dsRNA。 最后，细菌 （DE3） 对四环素和羧苄青霉素均具有抗性，以维持 RNA 聚合酶 III 表达并防止不必要的细菌生长。

将转化的 HT115（DE3） 细菌传播在含有 12.5 ？g/ml 四环素和 25 ？g/ml 羧苄青霉素的 LB 琼脂平板上。在 37 ？C 和第二天早上细菌菌落将出现在平板上。然后，选择一个细菌菌落，并将其加入 1 ml 含有 100 ？g/ml 氨苄青霉素的 LB 肉汤中，以选择含有质粒的细菌。在 37 ？C 伴激动。过夜孵育后，向培养物中加入 5 ml 含有 100 ？g/ml 氨苄青霉素的 LB 肉汤，并在 37 °C.

下再孵育 4-6 小时。一旦细菌准备好，就需要准备 RNAi 蠕虫板进行喂养。RNAi 蠕虫板包含：琼脂、水、羧苄青霉素、蠕虫培养基混合物和 IPTG，以诱导细菌中的T7 DNA聚合酶，从而转录质粒中的dsRNA。 向 RNAi 蠕虫板中加入 0.5 ml 细菌培养物，并在 37 ？C，创建细菌草坪。

在将蠕虫添加到 RNAi 板之前，同步蠕虫的发育阶段很重要，这样观察到的任何表型差异都不会成为发育阶段的伪影。为了同步发育阶段，首先对铂丝镐进行火焰消毒。

使用蠕虫挑选将 L4 蠕虫添加到每个 RNAi 板中，并在 20 ？C，让它们成为年轻的产卵成虫。 接下来，将年轻人转移到新的 RNAi 板中，并在 20 ？C，在此期间产卵。 一旦所有成虫都被移除，这些卵将在发育上同步。最后，让蠕虫在 RNAi 平板上生长，直到它们达到感兴趣的分析发育阶段。

为了可视化蠕虫，必须用 4% 琼脂垫制备载玻片。首先，用标记胶带粘住 2 个载玻片，形成垫片，确保琼脂垫的厚度均匀。在两个垫片之间放置一个干净的载玻片，并将约 150 ？l 4% 熔融琼脂移液到载玻片上。用垂直于垫片的附加载玻片快速覆盖熔融琼脂。轻轻分离载玻片，琼脂垫将粘附在其中一个载玻片上。

接下来，在琼脂垫中加入 10 ？l 麻醉剂，例如叠氮化钠，以固定动物。使用铂丝镐，将蠕虫转移到带有麻醉剂的琼脂垫上，并添加盖玻片。最后，在显微镜下观察蠕虫。将 RNAi 基因敲低的蠕虫与对照进行比较，并注意大小、发育阶段、形态、荧光标记蛋白定位模式和其他潜在表型的差异。

RNA 干扰最有价值的应用之一是能够轻松进行反向遗传筛选。反向遗传筛选是一种通过敲除已知基因集合并评估表型结果来发现基因功能的方法。例如，研究人员可以使用表达秀丽隐杆线虫基因组中几乎所有基因 dsRNA 的细菌文库。这些细菌在多孔板上培养并喂给蠕虫。然后，可以评估许多基因的 RNAi 敲低的表型效应，从而深入了解正常的体内基因功能。

自动遗传筛选是一种具有极高通量的反向遗传筛选。在自动基因筛选中，通过使用机器人处理数千个细菌克隆，并使用专用仪器进行定量分析，可以很容易地敲除整个秀丽隐杆线虫基因组。

例如，表达抗微生物肽基因 nlp 29 的转基因荧光报告基因的蠕虫，通过细菌喂养受到数千个基因的 RNAi 敲低。同时，蠕虫被引入真菌孢子。然后，可以评估抗菌肽对真菌的反应。

秀丽隐杆线虫的发育经常使用 RNAi 进行研究。 科学家可以使用 RNA 干扰来敲低任何感兴趣的基因（或基因集合），并准确评估该基因如何影响发育和/或发育时间过程中的过程。例如，RNAi 敲低可能揭示敲低时延迟发育的基因，或参与器官发育的基因。

您刚刚观看了 JOVE 对秀丽隐杆线虫中 RNA 干扰的介绍。 我们回顾了 RNA 干扰的工作原理以及如何通过细菌喂养在秀丽隐杆线虫中使用 RNA 干扰。RNA 干扰是反向遗传筛选（包括自动化高通量筛选）的宝贵工具，也是研究发育的有用工具。 感谢观看！