Name: Intravitale Video Microscopie Metingen van retinale bloedstroom in Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Leer intravitale videomicroscopie voor het meten van retinale bloedstroom bij muizen met fluorescerende microsferen en dextran. Deze methode kwantificeert vaatdiameters en bloedstroomsnelheden in arteriolen en venulen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gefinancierd door NIH EY017599 (NRH).

De procedures waarbij het gebruik van dieren betrokken is, werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor Dierenzorg en -gebruik van LSUHSC-S en werden uitgevoerd volgens de criteria die zijn geschetst door de National Institutes of Health.
1. Voorbereiding van perfusieoplossingen
<ol>
	<li>Soniceer een 1% (op gewicht) stamoplossing van 1,9 µm diameter microsferen.</li>
	<li>Trek ~25-30 x 106 groen fluorescerende microsferen (dat wil zeggen, ~10 µl van de stamoplossing) op in een 300 µl spuit. Verdun de microsferen door nog eens 240 µl zoutoplossing in de spuit te trekken.</li>
	<li>Bereid een 50 µl oplossing van 2 x 106 moleculair gewicht fluorescerende dextran opgelost in steriele zoutoplossing, met de geïnjecteerde dosis in het bereik van 3-10 mg/kg. Houd de dextran bedekt in aluminiumfolie tot het moment van infusie.</li>
</ol>
2. Dierderanesthesie en vasculaire canulerings
<ol>
	<li>Verdoof het dier voor chirurgische inbrenging van vasculaire canules en voor stationair positioneren onder een microscoopobjectief. Er zijn veel keuzes in verdovingsprotocollen beschikbaar, met verschillende voor- en nadelen, en potentiële effecten op systemische parameters. Onder de vele verschillende keuzes zijn een combinatie van ketamine (100-150 mg/kg), xylazine (10 mg/kg), en acepromazine (2 mg/kg), of een combinatie van ketamine (50 mg/kg) en pentobarbital (50 mg/kg).  De beschreven procedures zijn acuut en eindigen met euthanasie geïnduceerd door een overdosis pentobarbital (150 mg/kg) gevolgd door een thoracotomie; opname van een pijnstiller is niet nodig voor de terminale procedure.</li>
	<li>Houd een verwarmingskussen onder het dier voor de rest van het experiment.</li>
	<li>Houd de ogen vochtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing tijdens de daaropvolgende chirurgische inbrengingen van vasculaire canules.</li>
	<li>Bereid een vasculaire canule voor voor daaropvolgende infusies van fluorescerende tracers. Een stuk polyethyleenbuis van 20 cm lengte (bijvoorbeeld, 0,28 mm binnendiameter; 0,61 mm buitendiameter) wordt op de punt van een spuitnaald geplaatst, waarbij het scherpe uiteinde van de naald vooraf gebroken is door heen en weer te buigen met een hemostaten.</li>
	<li>Vul een spuit en buis met heparine (25 U/ml) zoutoplossing.</li>
	<li>Scheer een kant van de onderbuik en maak een incisie om de femuraal vene bloot te leggen.</li>
	<li>Om de femuraal vene te canuleren, zet het vat vast met een 5,0 naald, maak een gedeeltelijke incisie van het vat (ongeveer de helft van de vatdiameter), en breng de buis in het vat, zet de buis vast met de naald die om het gecanuleerde deel is gebonden.</li>
</ol>
3. Voorbereiding voor intravitale microscopie
<ol>
	<li>Verwijd de pupil van het oog met een druppel 1% tropicamide oogdruppels gevolgd door een druppel 2,5% hypromellose oogdruppels.</li>
	<li>Bedek het oog met een 5 mm glazen deksel.</li>
	<li>Plaats het dier op een perspex plaat, die onder het microscoopobjectief van een rechtopstaande microscoop gepositioneerd zal worden. Plaats strategisch chirurgisch gaas onder het hoofd om een directe as door het objectief naar de centrale retina en optische schijf mogelijk te maken.</li>
	<li>Focuseer door de microscoop op de optische schijf, vind de schijf met een laagvermogen 4X objectief en gebruik een fluoresceïne filter.</li>
</ol>
4. Infusie van fluorescerende microsferen om snelheden te meten
<ol>
	<li>Gebruik een 4X objectief, focus op de retina met de optische schijf in het centrum van het gezichtsveld.</li>
	<li>Infundeer de oplossing van fluorescerende microsferen met een snelheid van 250 µl/min/kg.</li>
	<li>Neem video-opnamen van de zichtbare retina rond de optische schijf, met een camerabelichtingstijd van ~8 msec.</li>
	<li>Stop de microsferen infusie wanneer een voldoende duur van video is opgenomen (1-2 min); een deel van de microsferen oplossing zal waarschijnlijk ongebruikt achterblijven.</li>
</ol>
5. Infusie van een fluorescerende plasmamarker om diameters te meten
<ol>
	<li>Gebruik een 4X objectief, focus op de retina met de optische schijf in het centrum van het gezichtsveld.</li>
	<li>Infundeer de voorbereide oplossing van fluorescerend dextran als bolus in de femuraal vene gedurende ~5 sec, terwijl gevideo-opgenomen wordt. Deze video zal helpen bij het bepalen van de identiteit van de arteriolen vs venulen, waarbij de arteriolen als eerste worden geperfundeerd. Voer deze stap uit met de camerabelichtingstijd ingesteld op ~8 msec, hoewel de precieze belichtingstijd niet kritiek is.</li>
	<li>Schakel over naar een 10X objectief en 20-40 msec belichtingstijd voor verbeterde resolutie om elk van de 4-7 arteriolen en 4-7 venulen in de oppervlakkige retina te video-opnemen. Focus op (en video-opneem) ongeveer een kwartier van het zichtbare gedeelte van de retina per keer, met het centrum van de optische schijf in een hoek van het gezichtsveld. Er moet een poging worden gedaan om de tijd dat het microscooplicht het weefsel belicht te minimaliseren om de mogelijkheid van licht/kleurstof-geïnduceerde fototoxiciteit17 te verminderen.</li>
</ol>
6. Video-analyse
<ol>
	<li>Gebruik een micrometer-schaal om het videosysteem te kalibreren voor een conversie van µm/pixel.</li>
	<li

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze techniek van intravitale videomicroscopie kan niet alleen op muizen worden toegepast, maar ook op ratten. Dit protocol is gebaseerd op slechts een paar aannames, maar is beperkt tot gebruik onder anesthesie en met pupilverwijding zoals we het hebben beschreven. De andere aannames en beperkingen zijn als volgt:
1. Aanname van minimale optische vergrotingsfout als gevolg van de refractieve aard van het oog. Zoals beschreven door anderen18-20, de methode om de ruim...

De retina is een van de meest metabolisch actieve weefsels in het lichaam en vereist bijgevolg een royale bloedtoevoer. Twee afzonderlijke circulaties voldoen aan deze vraag: de choroïdale circulatie voor het buitenste deel van de retina en de retinale circulatie voor het binnenste deel van de retina. Onderzoek naar retinale perfusie is onmisbaar voor het begrijpen van de pathologische mechanismen en gevolgen van diabetische retinopathie, door zuurstof geïnduceerde retinopathie, retinale arteriële of veneuze occlusie en beroerte. Er zijn verschillende methoden gebruikt om retinale bloedstroom te kwantificeren, waarbij elke techniek zijn voordelen, nadelen, beperkingen en aannames heeft. Onder deze technieken zijn infusie van 7-8 µm diameter microspheres die zich nestelen in precapillaire arteriolen1,2, kwantitatieve autoradiografie3,4, optische microangiopathie-optische coherentietomografie5,6, magnetische resonantie beeldvorming7,8 en intravitale videomicroscopie9-16. De voordelen van de laatste omvatten directe live visualisatie van retinale vaten en stroming, een afhankelijkheid van slechts een paar kleine aannames en betaalbaarheid voor laboratoria met een fluorescentiemicroscoop met een aangesloten videocamera. In eerdere studies van intravitale videomicroscopie9-16 is fluorescerende dextran gebruikt als plasmamarker en fluorescent gelabelde rode bloedcellen (van een donordier) zijn gebruikt als snelheidsmarkers. In het huidige protocol worden 1,9-µm diameter fluorescent gelabelde microspheres, in plaats van rode bloedcellen, gebruikt om snelheid te meten, waarbij deze wijziging de behoefte aan een bloedceldonor elimineert.

<table><tbody><tr><td>Fluorescente microspheres</td><td>Bangs Laboratories</td><td>FS04F/10584 (groen)</td><td></td></tr><tr><td>Hoge molecuulgewichts fluorescente dextran</td><td>Molecular Probes</td><td>D-7137 (groen); D-7139 (rood)</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopsysteem</td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600FN + accessoires</td><td></td></tr><tr><td>4X objectief</td><td>Nikon</td><td>Plan Fluor 4X</td><td>numerieke opening 0,13; werkafstand 17,2 mm</td></tr><tr><td>10X objectief</td><td>Nikon</td><td>Plan 10X</td><td>numerieke opening 0,25; werkafstand 10,5 mm</td></tr><tr><td>Tropicamide oogdruppels</td><td>Bausch Lomb</td><td>1% Tropicamide</td><td></td></tr><tr><td>Hypromellose oogdruppels</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2,5% Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware</td><td>University of California San Francisco Vale Lab</td><td>Micro-Manager</td><td></td></tr><tr><td>Digitale videocamera voor microscopie</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>1392 x 1040 pixelresolutie; pixelgrootte 6,45 x 6,45 &mu;m</td></tr></tbody></table>

intravitale video microscopie metingen van retinale bloedstroom in muizen

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Veranderingen in de retinale bloedstroom kunnen bijdragen aan, of een gevolg zijn van, oculaire ziekten en visuele disfunctie. Daarom kan kwantificering van veranderde perfusie onderzoek naar de mechanismen van retinale pathologieën ondersteunen. Intravitale videomicroscopie van fluorescerende tracers kan worden gebruikt om vasculaire diameters en bloedstroomsnelheden van de retinale vaatbundel te meten, specifiek de arteriolen die zich aftakten van de centrale retinale slagader en de venulen die leiden naar de centrale retinale ader. Bloedstroomsnelheden kunnen worden berekend uit de diameters en snelheden, met de som van arteriolaire stroming, en afzonderlijk veneuze stroming, die waarden leveren van de totale retinale bloedstroom. Dit artikel en de bijbehorende video beschrijven de methoden voor het toepassen van deze techniek op muizen, die omvatten 1) de voorbereiding van het oog voor intravitale microscopie van het anesthetiseerde dier, 2) de intraveneuze infusie van fluorescerende microspheren om de bloedstroomsnelheid te meten, 3) de intraveneuze infusie van een fluorescerend dextran met een hoog molecuulgewicht, om de microscopische visualisatie van de retinale microvaten te ondersteunen, 4) het gebruik van een digitale microscoopcamera om video's van de geperfuseerde retina te verkrijgen, en 5) het gebruik van beeldverwerkingssoftware om de video te analyseren. Dezelfde technieken kunnen worden gebruikt voor het meten van retinale bloedstroomsnelheden bij ratten.

Afbeelding 1 toont individuele videoframes van een experiment, waarbij de panelen A-D en F-I fluorescerende microsfeerstreaks weergeven, vastgelegd met een 4x-objectief en een belichtingstijd van 8 ms (en binningsfactor van 2 x 2 pixels om de videobestandsgrootte te verkleinen). Afbeelding 1E toont de oriëntatie van de retinale vaatstructuren in de andere panelen van de afbeelding. Niet elk videoframe zal een scherp gefocuste fluorescerende streak bevatten; echter, sommige frames kunnen ...

Intravitale microscopie kan bij dieren worden gebruikt om retinale vaatdiameters, bloedstroomsnelheden en totale retinale bloedstroom te visualiseren en te meten.

Intravitale Video Microscopie Metingen van retinale bloedstroom in Muizen

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Het algemene doel van deze procedure is om het retinale bloedstroom in muizen te meten. Dit wordt bereikt door eerst fluorescerende microsferen te infunderen via de canuleerde dijbeenader van een verdoofde muis. De tweede stap is om de microsferen die door de retinale bloedvaten van de muis stromen op video vast te leggen.Vervolgens worden fluorescerende dextran via de dijbeenader ingebracht en wordt video vastgelegd terwijl het door de retinale bloedvaten stroomt. De laatste stap is om de microsfeersnelheden en de diameters van de bloedvaten te meten aan de hand van de opgenomen video's voor een berekening van het retinale bloedstroom. Een belangrijk voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om de bloedstroom in het netvlies nauwkeurig te meten met behulp van een standaard fluorescentiemicroscoop.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het netvliesveld, zoals in welke mate veranderingen in de bloedstroom bijdragen aan diabetische retinopathie. Hoewel we deze techniek zullen demonstreren in het netvlies van een muis, kan de algemene methode worden gebruikt in andere weefsels en ook bij ratten.Soniceer een 1%-stockoplossing van 1,9 micron diameter

intravital-video-microscopy-measurements-of-retinal-blood-flow-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Intravitale microscopie van de muis M. cremaster microcirculatie biedt een unieke en goed gestandaardiseerd in vivo model voor de analyse van perifere beenmerg stamcellen migratie.

Intravitale Microscopie van de microcirculatie in de Muis cremasterspier voor de Analyse van de perifere stamcelmigratie

Dit artikel beschrijft een gedetailleerde methode voor de dynamische meting en kwantificering van bloedstroomsnelheid binnen individuele bloedvaten van de muizenlevervaten met behulp van intravitale microscopie-beeldvorming in combinatie met een specifieke methodologie voor beeldverwerving en analyse.

Intravitale Microscopie Imaging van de lever volgende<em&gt; Leishmania</em&gt; Infectie: een beoordeling van de lever Hemodynamica

Live-imaging van de gelabelde bloedcellen in de oculaire circulatie kan informatie verschaffen over ontsteking en ischemie bij diabetische retinopathie en leeftijdgerelateerde macular degeneratie. Een protocol om bloedcellen te labelen en de gemarkeerde cellen in de retinale circulatie af te beelden is beschreven.

Fluorescent Dye Etikettering van Erythrocyten en Leukocyten voor het bestuderen van de Flow Dynamics in de retinale circulatie van de muis

Veel visie-bedreigende oogbeschadigingen en/of ziekten worden geassocieerd met disfunctionele retinale microvessels. De meting van de retinale arteriole reacties is daarom belangrijk om te onderzoeken van de onderliggende pathofysiologische mechanismen. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor muis retinale arteriole isolatie en voorbereiding te beoordelen van de effecten van vasoactieve stoffen op vasculaire diameter.

Voorbereiding stappen voor meting van reactiviteit in muis retinale arteriolen Ex Vivo

Een open vaatvensterbenadering met behulp van fluorescerende tracers biedt voldoende resolutie voor cochleaire bloedstroom (CoBF) -meting. De methode vergemakkelijkt de studie van structurele en functionele veranderingen in CoBF bij muizen onder normale en pathologische omstandigheden.

Meting van de striale bloedstroom in slakkenhuis van muizen met behulp van een open vaatvenster en intravitale fluorescentiemicroscopie

In vivo beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie in gezondheid en ziekte. Dit protocol beschrijft transpupillaire beeldvorming van het netvlies van de muis met een standaard microscoop met twee fotonen. Het demonstreert ook verschillende in vivoimaging-methoden om fluorescerend meerdere cellulaire cohorten van het netvlies te labelen.

Transpupillaire twee-fotonen in vivo beeldvorming van het netvlies van de muis

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.

Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

Hier presenteren we drie data-analyseprotocollen voor fluoresceïneangiografie (FA) en optische coherentietomografie (OCT) beelden in de studie van Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Vasculaire letseluitlezingen in het netvlies van muizen om de reproduceerbaarheid te bevorderen

Het retinale vaatstelsel van muizen is bijzonder interessant voor het begrijpen van de mechanismen van vasculaire patroonvorming. Dit protocol meet automatisch de diameter van de retinale vaten van muizen op basis van fluorescerende angiografie-fundusbeelden op een vaste afstand van de optische schijf.

Het meten van de diameter van het netvliesvat van fluorescerende angiografiebeelden van muizen

Leer intravitale videomicroscopie voor het meten van retinale bloedstroom bij muizen met fluorescerende microsferen en dextran. Deze methode kwantificeert vaatdiameters en bloedstroomsnelheden in arteriolen en venulen.

Intravitale Video Microscopie Metingen van retinale bloedstroom in Muizen

Meer video's verkennen