小鼠的基因分型

基因分型是检测某特定DNA序列在一个生物基因组中是否存在的过程。

因为基因可影响小鼠的表型，能够探测单个小鼠的基因组成，或称"基因型"，是将某表型归因于一个特定基因的关键。本短片将探讨小鼠遗传学，演示基因分型方法的关键步骤，并解释如何分析基于PCR的基因分型结果。

为了了解研究人员在做小鼠基因分型时寻找的是什么，让我们回顾一下一些常见的小鼠遗传学操作。

要研究一个基因，科学家们经常通过改变其基因序列破坏其功能。

然而，小鼠是二倍体，所以任何基因它们都有两个拷贝。由于大多数基因只需要一个正常拷贝就能有功能，所以我们在研究表型前必须培育两个基因拷贝都被破坏的小鼠。

这种基因型被称为"纯合敲除型"，或更常见的简称为"基因敲除型"。相反，含两个有功能拷贝的正常小鼠被称为"纯合野生型，"或者"野生型"。最后，将含一个有功能拷贝的小鼠称为"杂合型"或"杂合子"。

除了去除遗传物质，有些实验需要引入DNA序列到小鼠基因组中。这些插入的DNA片段，被称为"转基因"，而携带这些DNA片段的小鼠是"转基因的"。最常见的导入小鼠的"转基因"是一种驱动表达水母的绿色荧光蛋白或GFP基因。通过使用组织特异性启动子（一种"促进"基因活性的调节序列）驱动GFP的产生，我们可以很容易地通过绿色荧光确定特定组织类型的细胞。

由于许多遗传变化不会产生如GFP表达这种容易观察到的表型，我们需要将小鼠进行基因分型，以确定哪些特定的动物应该在实验中使用。进行基因分型前，小鼠应仔细标记，这样以后可以识别它们。不，您需要比这更永久的标记。一个常用的方法是在小鼠耳朵上做切口，使得切口的位置与数目对应于一个ID号。

一旦小鼠标记完毕，收集一小块组织（通常为用剃刀刃或剪刀剪下的2 - 5 mm的尾巴），从中提取DNA。如果你从多个小鼠中收集组织，标记好刀片的使用部分，以确保您不会在接下来的动物上使用相同的部分，因为这可能会导致样本的交叉污染。

首先要将遗传物质与来自组织的其它成分分离，将样品用含有蛋白酶K的裂解缓冲液消化。过夜消化后，离心样品以沉淀毛发和其它任何未消化的材料。要从消化裂解液中分离DNA，一个简单而有效的方法是添加乙醇以沉淀核酸。短暂孵育后，将样品再次离心，收集沉淀下来的DNA。

接下来我们用70％乙醇洗涤，以除去过量的盐，然后将DNA沉淀再重悬于水或缓冲液中，并准备进行基因分型。

确定一个特定的DNA序列是否存在于您的小鼠中有很多办法。多数方法都需要先使用聚合酶链式反应PCR，扩增感兴趣的遗传区域。如想了解关于如何准备PCR的更多信息，请观看JoVE的科学教程"PCR反应指南。"

一种用来区分基因型的方法是检测PCR扩增片段的大小变化。比方说，您要筛选插入了700个碱基对大小基因的小鼠。 PCR后，野生型带是200个碱基对，而转基因带应该是900个碱基对。

将您的PCR产物跑胶，让反应产物在适当比例的琼脂糖凝胶中分离，这样您就可以辨别您的片段大小。野生型对照应该只有一条200个碱基对的野生型带;转基因对照应该只有一条900碱基对的带;而杂合子对照应该同时含有这两条带。最后，应包括一个"无模板"的对照，以确保所用试剂不含有任何污染的DNA，因此，它不应该产生任何带。

现在，我们确定对照PCR得到结果和预期一样，让我们看看未知小鼠的PCR。因为小鼠1和2各自都只有一条野生型带，它们是纯合野生型。小鼠4和6每个都只有一个转基因带，因此是纯合的转基因型。

小鼠3和5各有两条带，并因此是杂合子。

最后，当您回去找您想要的基因型的小鼠时，您只需要将耳朵切口的标志与小鼠的ID号匹配就行了。

理解了什么是基因分型以及它的操作后，让我们来看看一些例子说明为什么它是非常有用的。

在某些情况下，需要更复杂的遗传修饰以产生所需的表型。例如，要建立皮肤癌的小鼠模型，需要两个转基因。一个携带可诱导的"致癌基因"，或可导致癌症的基因，另一个携带Cre重组酶的基因，它只在皮肤中表达并能切除一段抑制癌基因表达的序列，从而使癌基因得到表达。要得到同时含有这两个转基因的后代，需将含每个转基因的杂合子小鼠进行交配。然后用基因分型来鉴定后代。

有时可能无法在实验之前对小鼠进行基因分型。例如这个研究胚胎心脏速率的实验，无法做到从胚胎中收集组织而不破坏它们的行为。因此，首先要仔细标记胚胎在母体中的位置，然后记录下超声测量结果。最后，收集尾巴活检来确定基因型对心脏速率的影响。

本短片已经演示了DNA提取的一种方法，但还有很多其他的方法。在直接PCR方法中，先将组织消化不到五分钟，然后将未消化的材料离心沉淀后，将上清液直接用于PCR，这样就无需进行DNA纯化。

您刚观看的是JoVE的小鼠基因分型的简介。本短片中，我们回顾了小鼠遗传学的基本知识，如何准备和分析小鼠的DNA样本，以及这项技术的一些实际应用。感谢观看！