使用吗啉代寡核苷酸进行基因沉默

基因沉默技术在发育生物学领域中被广泛应用。基于吗啉代的基因敲低方法通常可使研究人员识别并鉴定参与重要细胞过程的基因。由于其高效性、高特异性以及低成本，反义吗啉代寡核苷酸目前在多种模式系统中广受欢迎，包括小鼠、鸡和斑马鱼。

本视频将概述吗啉代的作用机制和显微注射策略、关键的实验对照，以及当前实验室如何利用吗啉代来研究脊椎动物的发育过程。

吗啉寡核苷酸最初被开发用于抑制活细胞和生物体内RNA转录本的翻译。通常，吗啉寡核苷酸是由25个寡核苷酸通过中性电荷骨架连接而成的合成分子。

尽管吗啉寡核苷酸在结构上与DNA非常相似，但其磷酸糖骨架中的糖基团被吗啉环所取代。这一简单的结构改变提高了吗啉寡核苷酸在细胞内的稳定性，并降低了生产成本。

在细胞内，吗啉寡核苷酸通过碱基互补配对靶向特定的RNA序列。吗啉寡核苷酸与RNA结合的位置决定了其具体的作用机制。

剪接阻断型吗啉寡核苷酸结合于特定的剪接位点，抑制转录本的正确加工；而翻译阻断型吗啉寡核苷酸则结合于基因5'非翻译区靠近翻译起始位点的区域，阻止核糖体的组装。这两类吗啉寡核苷酸均可降低功能性靶蛋白的表达水平。

在使用吗啉寡核苷酸（morpholinos）设计实验时，有几个重要事项需要考虑。吗啉寡核苷酸可用于多种模式系统，因此选择一个能够有效回答特定生物学问题的模型系统至关重要。

吗啉寡核苷酸为商业合成，研究人员可免费获得专业的设计协助；但由于其具有序列特异性，因此在设计前应预先获取所有特定吗啉寡核苷酸靶标的基因信息。

在斑马鱼模型系统中，由于其进化祖先曾发生过全基因组复制事件，因此许多在其他脊椎动物中为单拷贝的基因在斑马鱼中往往存在两个拷贝。因此，为成功模拟人类发育过程中蛋白质的缺乏表型，可能需要同时敲低这两个斑马鱼同源基因。

设计良好的实验对照与设计靶向吗啉寡核苷酸同样重要。特定的吗啉寡核苷酸可能与不同基因上的特定序列结合。建议使用针对同一基因的两个独立且不重叠的吗啉寡核苷酸，以确保所观察到的表型变化确实是由目标基因的敲低所引起。

在讨论了吗啉寡核苷酸（morpholino）的实验设计之后，接下来我们来看看如何将吗啉寡核苷酸导入斑马鱼中。

在此，我们将描述对斑马鱼进行吗啉寡核苷酸显微注射的方法。如需进一步了解显微注射的具体操作细节，请参考 JoVE 科学教育视频《斑马鱼显微注射技术》。

吗啉寡核苷酸通常在斑马鱼胚胎发育至一细胞期到四细胞期之间，注射到卵黄或细胞质中。由于胚胎细胞之间存在细胞质连接，水溶性的吗啉寡核苷酸能够迅速扩散并广泛分布于整个生物体中。由于斑马鱼胚胎在 28.5°C 下培养，吗啉寡核苷酸在细胞内具有良好的稳定性。

每种吗啉寡核苷酸的最佳注射浓度和注射体积需通过实验经验确定。通常选择在至少 50–75% 的注射胚胎中能产生明确且可重复表型的最低剂量，以避免胚胎致死或非预期的脱靶效应。

大多数使用吗啉寡核苷酸的斑马鱼表型在受精后前三天内被观察到，基因沉默效果一般可持续至第五天。对于阻断剪接的吗啉寡核苷酸，可通过 RT-PCR 检测天然转录本与异常转录本的相对含量；而对于阻断翻译的吗啉寡核苷酸，基因敲低水平可通过 Western blot 进行评估。

斑马鱼胚胎的快速体外发育和透明特性使其许多早期生物学过程易于观察。通常可通过明场或荧光显微镜观察形态，以及通过行为评估，来分析和判定吗啉代寡核苷酸（morpholino）的表型。

在确定吗啉代寡核苷酸表型后，可进行RNA拯救实验以验证靶向特异性。在利用吗啉代寡核苷酸敲低内源性mRNA后，注射编码相同蛋白质但不含吗啉代靶序列的合成mRNA。如果注射的RNA能够恢复生物体的野生型表型，则可证明所观察到的吗啉代寡核苷酸表型确实是由靶基因的敲低所致。

现在您已经了解了吗啉寡核苷酸（morpholinos）的基本概念以及如何开展受控的吗啉寡核苷酸实验，接下来让我们看看目前生物实验室中如何应用吗啉寡核苷酸技术。

在细胞生物学中，吗啉寡核苷酸被用于研究早期发育过程。例如，库普弗囊泡（Kupffer's vesicle）中由纤毛驱动的液体流动可调控斑马鱼的左右体轴模式。在对照注射胚胎中，液体呈逆时针流动；而当沉默调控纤毛细胞排列的基因后，液体流速和方向均受到破坏。

吗啉寡核苷酸也非常适用于快速、可靠地模拟人类遗传性疾病。通过调控蛋白表达，可轻松重现功能缺失表型，例如在一种斑马鱼的人类发育不良模型中，可观察到肾囊肿、心包水肿以及尾部卷曲等表型。此外，通过使用野生型或突变型mRNA来挽救吗啉寡核苷酸诱导的疾病表型，可实现对致病突变进行快速的体内功能检测。

由于吗啉寡核苷酸可通过多种方式导入活细胞，因此在器官再生与发育研究中具有重要价值。通过显微注射结合电穿孔技术将吗啉寡核苷酸靶向导入特定组织，研究人员得以在成年斑马鱼中研究鳍的生长和视网膜形成过程。

您刚刚观看了 JoVE 关于使用吗啉代寡核苷酸进行基因沉默的简介视频。在本视频中，我们讨论了吗啉代寡核苷酸的结构与作用机制、常见的应用方式，以及评估靶向基因沉默效果和效率的重要方法。由于吗啉代寡核苷酸设计简便、特异性高且成本较低，它们将在反向遗传学领域持续发挥重要作用，助力研究人员对参与疾病与发育过程的基因进行功能性分析。感谢观看！