模式生物的基因工程

基因工程是一种有价值的工具，用于在称为转基因的过程中对模式生物的基因组进行修饰。在发育生物学中，这一方法常用于表达可在活体组织中可视化观察的修饰基因。或者，基因工程也可用于阻止或破坏蛋白质的表达，以研究特定基因在发育过程中的功能。

本视频将概述该技术背后的原理，回顾一些基因工程的操作流程，并重点介绍这些技术在实验室中的应用方式。

首先，让我们探讨转基因技术背后的一些重要概念。这涉及将DNA插入模式生物的基因组中。根据研究目标的不同，有多种实现方法。

第一种方法是引入经过修饰的基因，以揭示由突变引起的生理功能或形态学变化。另一种方法是插入未修饰的野生型基因的额外拷贝，用于研究基因过表达所产生的效应，而这种效应往往与突变造成的损害同样严重。还有一种不同的策略是插入包含可视化标签的融合蛋白，例如绿色荧光蛋白（GFP），以便在活体动物中追踪基因表达的位置和时间动态。

将要插入基因组的DNA片段必须经过精心设计，以实现预期的表达模式和结果。其中启动子是一个关键组分，它是决定基因在何时、何处表达的序列元件。某些启动子在几乎所有组织中均普遍表达，而另一些则仅在特定组织中具有活性。此外，还可使用可诱导型启动子，这类启动子可通过化学物质处理或高温暴露来激活，从而控制基因表达的时间。

为了在组织中实现稳定表达，转基因必须首先整合到基因组中。为实现这一目标，转基因可包含与生物体基因组特定区域相匹配的侧翼DNA序列，从而通过同源重组过程将转基因整合至宿主DNA中。此外，在某些物种中，可利用被称为转座子的特殊元件提高转基因效率，这些元件含有转座酶的识别位点，由转座酶催化将转基因随机插入基因组中。

了解了转基因设计的一些基本原理后，接下来我们来回顾如何制备转基因动物。首先，通过 PCR 扩增目的基因以构建转基因载体。然后将扩增得到的片段克隆到载体中，载体是一种能够将转基因带入细胞的 DNA 分子。这些载体通常包含可在细菌（如 E. coli）中高效扩增转基因的元件。完成扩增后，需从细菌培养物中纯化出载体。

转基因动物的制备是通过将纯化的 DNA 注射到胚胎中实现的。在鱼类和蛙类中，通常将构建好的载体直接注射到单细胞期胚胎的卵黄或细胞质中。对于转座子介导的转基因技术，需在注射混合物中加入编码转座酶的转录本。

在小鼠中，转基因可通过操作新受精的卵细胞实现，此时精子和卵子的原核尚未融合。将构建物直接注射到较大的原核中，随着细胞分裂，外源 DNA 可能整合到基因组中。随后必须将这些受精卵移植到假孕雌鼠的子宫内，使其继续发育。

转基因效率存在差异，因此需要对动物进行筛选，以鉴定出外源构建物成功整合到基因组中的后代。可通过观察插入的荧光标记（便于识别）进行筛选，也可通过分子生物学方法检测，例如对从小块组织中提取的基因组 DNA 进行 PCR 分析。

基因工程的第二种方法侧重于特异性基因靶向，以破坏基因功能。实现这一目标有多种途径。其中一种相对较新的方法称为基因组编辑，该方法利用一类称为核酸酶的序列特异性酶，这些酶可切断DNA骨架，并在DNA修复过程中导致基因发生突变。

另一种靶向方法涉及使用同源重组，将目标基因替换为外源DNA，或替换为两侧带有重组酶识别序列的基因拷贝。当存在重组酶时，被识别序列包围的片段将从基因组中被切除。这种方法被称为条件性基因敲除，通过在特定组织中或特定时间点表达重组酶，可实现对基因切除的精确控制。

让我们回顾一下通过同源重组技术制备基因敲除小鼠的一般流程。在此过程中，需要构建一个重组载体，其中基因组DNA序列的一部分被外源DNA所取代。这段外源DNA通常编码另一个基因，例如抗生素抗性基因，以便在后续步骤中筛选成功修饰的细胞。

实验开始时，从小鼠早期胚胎（称为囊胚）的内细胞团中分离获得胚胎干细胞。随后通过电穿孔法将线性化的载体导入干细胞中，该方法利用电脉冲在细胞膜上产生瞬时的孔隙。接着将细胞在含有抗生素的培养基中孵育，以清除未携带转基因的细胞。

完成筛选后，将这些干细胞注射到另一处于囊胚阶段的小鼠胚胎中。随后将胚胎移植至雌性小鼠子宫内继续发育。出生的幼鼠将是嵌合体，其组织由野生型和基因敲除型细胞共同组成。部分嵌合体的生殖系中会含有基因敲除细胞，当这些嵌合体小鼠交配繁殖时，可将中断的基因传递给后代，从而建立新的基因敲除品系。

你已经了解了发育模型遗传工程的基本原理，现在让我们来看一些实际应用。

发育研究通常使用荧光标记的蛋白质来识别细胞并研究其发育过程。通过使用组织特异性启动子，可以对转基因生物进行改造，使其在特定细胞中表达荧光蛋白，例如神经嵴细胞。结合先进的成像技术，可对荧光标记的细胞进行实时成像，使研究人员能够直接观察复杂的发育事件。

遗传工程的另一个重要用途是研究特定基因及其在疾病表型中的作用。在此方法中，利用核酸酶（如 TALENs）将靶向突变引入小鼠的特定基因中。通过 PCR 检测小鼠体内该基因的突变拷贝数，即零个、一个或两个拷贝。携带两个突变拷贝的胚胎可用于深入研究，以确定该基因在发育过程中的功能。

利用条件性基因敲除技术，科学家可以确定某一基因在特定细胞群体中的功能。在此例中，一个两侧带有 loxP 位点的基因在整个胚胎中表达，但 Cre 仅在内皮细胞中表达，从而导致心脏和血管中的基因被特异性删除。这种组织特异性的基因敲除导致胚胎心率出现可测量的变化，展示了如何在不改变整个生物体的前提下，研究基因的局部作用。

您刚刚观看了 JoVE 关于转基因技术的简介。这些技术可帮助您了解基因工程的基础知识、涉及的部分方法，以及其在日常科学研究中的应用。基因工程可广泛应用于多种生物体，并将继续成为研究和理解遗传学在发育性疾病以及成年期出现的疾病中所起作用的重要工具。感谢观看！