整体组织 原位 杂交

整体装片 原位 杂交技术是一种强大的方法，可使科学家理解胚胎发育的分子基础。“整体原位杂交”（whole-mount）表示将使用整个胚胎，而不仅仅是组织切片。原位“in position” 是一个拉丁短语，意为“在原位”。最后，“杂交”指的是人工合成的RNA分子与生物体细胞内的mRNA转录本之间的互补结合。

本视频将演示该技术的操作流程、预期结果及部分应用，有助于更好地理解发育障碍。

在胚胎发育过程中，控制生物体形态发生的基因以特定的时间和空间限制模式表达。

人工合成的RNA探针，称为核糖探针（riboprobes），可通过互补结合来检测mRNA。核糖探针使用含有“半抗原”（haptens）的特殊核苷酸进行标记，例如二硝基苯酚、生物素或地高辛。半抗原是当与大分子结合时可引发免疫反应的小分子，因此可作为抗体结合的靶标。这些检测抗体与酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）偶联，催化化学反应，使荧光或有色染料得以沉积。

传统的原位杂交技术需要制备胚胎的组织切片，以便检测内部结构。因此，要全面评估整个生物体内的基因表达，需借助计算机软件对5–6 μm厚的组织切片进行重建。然而，随着整体装片（whole-mount）技术的发展，可在整个胚胎范围内实现长距离的基因表达分析。

在了解了整体原位杂交（whole-mount in situ hybridization）背后的原理之后，让我们逐步浏览实验方案。

该实验的第一步是确定待研究模式生物中的目标序列。随后使用含有RNA聚合酶启动序列的引物，通过PCR扩增目标DNA序列。接着，利用带有单倍体标记的核苷酸在体外转录扩增后的DNA模板。至此，带有单倍体标记的核糖探针已准备就绪，可用于杂交步骤。

通过甲醛固定来准备用于杂交的胚胎，甲醛是一种交联试剂，可稳定蛋白质并防止RNase降解。固定后，用含少量去污剂（如Tween）的磷酸盐缓冲液多次洗涤以去除甲醛。为了去除细胞脂质并促进探针进入组织，胚胎需经梯度甲醇溶液逐步脱水，例如：25%、50%、75%、100%甲醇。胚胎可在-20°C条件下保存于100%甲醇中长达一个月或更长时间。

为使胚胎适用于杂交，需通过逐步降低甲醇浓度的梯度甲醇洗涤进行再水化。随后用蛋白酶消化胚胎，以促进核糖探针向组织内的扩散。将标记的核糖探针加入胚胎中，开始杂交反应。

杂交后需进行洗涤，以去除非特异性结合的杂交信号。加入RNase A和RNase T1，以降解未完全杂交的单链RNA探针。通过与单倍体标记的核糖探针特异性结合的酶标抗体复合物来检测已杂交的探针。如前所述，碱性磷酸酶等酶与特异性识别单倍体的抗体相连，通过添加酶底物引发显色反应。反应产物形成深紫色沉淀，标记出mRNA表达的位置，如下图示例所示。

现在您已经了解如何进行整体装片 原位 杂交技术，让我们来看一些该技术的应用。

整体装片 原位 杂交技术已被用于帮助科学家应对疟疾、登革热和西尼罗河病等致命的蚊媒疾病。通过鉴定蚊子繁殖和发育相关基因，可设计出新的生物或化学杀虫剂，以更有效地靶向传播疾病的蚊子。

该技术的另一项应用涉及表征与暴露于致畸剂（即干扰胎儿发育的物质）相关的基因表达模式变化。

此处，整体装片 原位 在斑马鱼的胎儿酒精综合征模型中，利用杂交技术鉴定出在酒精暴露后表达模式发生变化的基因。这有助于开发治疗策略，以减轻孕期酒精暴露所导致的不良后果。

整体装片 原位 杂交也可用于验证与先天性疾病相关的表型变化。通过合成的突变mRNA将与巴德-比德尔综合征相关的突变导入斑马鱼胚胎。经过一定时间后，根据缺陷的严重程度将胚胎分组。通过可视化突变基因下游基因的表达来验证表型变化。因此，整体标本 原位 结合表型评分的杂交技术有助于更深入理解特定突变在发育缺陷中的作用。

您刚刚观看了JoVE关于整体装片的视频 原位 杂交。该技术是一种强大的工具，可实现对生物体内基因表达在时间和空间上的精确定位与表征。整体样本 原位 杂交技术目前正被用于构建多种模式生物在发育过程中基因表达模式的图谱。这些研究可能有助于开发治疗人类疾病（包括癌症）的新疗法。感谢观看！