诱导多能性

诱导性多能干细胞与人类胚胎干细胞类似，能够分化为体内几乎所有类型的细胞，因此在再生医学领域具有广阔的应用前景。

人类胚胎干细胞（hESCs）来源于着床前的胚胎，而诱导性多能干细胞（iPSCs）则是由完全分化的体细胞重编程获得。

在本视频中，您将学习生成iPSCs的基本原理、将已分化细胞诱导为多能状态的逐步实验方案，以及该技术的多种下游应用和改进方法。

首先，让我们讨论一下从体细胞类型生成诱导多能干细胞（iPSCs）的基本原理。

已分化的细胞，例如皮肤细胞或神经元，是命运已经确定的细胞，它们被限定执行特定功能。另一方面，多能干细胞的命运尚未确定，能够分化为任何类型的细胞。

将已分化的细胞身份转变为多能状态的过程称为细胞重编程。该过程涉及改变细胞内的基因表达模式，因为细胞所产生蛋白质的种类和数量在决定细胞身份中起着关键作用。

诱导细胞重编程的方法之一是诱导某些转录因子的表达。转录因子是能够结合基因内调控序列的蛋白质。其中一些序列被称为“启动子”，可促进基因的转录。少数转录因子可以影响大量基因的表达，从而对细胞身份产生巨大影响。

已被证实能够诱导多能性的四种经典转录因子是 Oct4、Sox2、cMyc 和 Klf4。这些因子也被称为山中因子（Yamanaka factors），以发现其重编程作用的研究者命名。

有多种方法可用于诱导这些转录因子的表达，其中最常见且高效的方法是使用经过修饰的病毒将转录因子基因递送至细胞核内，使其整合到基因组中。

在此方法中，编码四种山中因子的基因分别被包装到不同的逆转录病毒中，并加入到已分化的细胞中。当细胞暴露于这些修饰病毒时，一小部分已分化的细胞会同时感染携带全部四种转录因子的病毒。这些细胞开始去分化，最终形成较大的球形多能干细胞簇。这种细胞簇的形成有助于诱导多能干细胞建立类似于体内（in vivo）干细胞的微环境，从而帮助其维持多能性。

既然您已经了解了诱导多能干细胞（iPSCs）生成的基本原理，接下来让我们一起学习一种通用的实验方案：利用病毒转导系统，诱导小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）重编程为多能状态。

在开始该实验前，请注意病毒可能感染人体细胞，因此严格遵守安全操作规范至关重要。

为启动转导过程，首先从含有高密度MEFs的培养皿中移除培养基，并用缓冲液清洗细胞。随后，加入含有蛋白酶（如胰蛋白酶）的溶液，使细胞从培养皿底部脱落。接着向培养皿中加入培养基，将脱落的细胞转移至离心管中。

离心后，将细胞沉淀重新悬浮于培养基中。然后对细胞进行计数，并调整浓度，以确保次日能够以最佳细胞数量进行病毒感染。将细胞在培养箱中孵育过夜。

待细胞在新的培养皿中贴壁后，更换新鲜培养基，并向培养皿中加入携带目标转录因子的基因工程病毒。将细胞与病毒共同孵育足够时间，以确保感染充分发生。孵育结束后，移除含有游离病毒的培养基，并更换为新鲜的胚胎干细胞培养基。

转导后的2至3周内，细胞应在37°C的培养箱中持续培养，并每天更换培养基。

经过该培养周期后，出现的iPSC克隆应已生长至足够大小，形态上类似于胚胎干细胞克隆，可进行挑取。将这些克隆转移至含有适当生长因子的新培养皿中，继续扩增培养。为验证其多能性，可对部分细胞群体进行多能性标志物染色检测。

现在您已经了解了如何从分化细胞中生成诱导多能干细胞（iPSCs），接下来让我们探讨这种极具价值的方法的一些下游应用及其改进策略。

iPSCs 的一个重要特性是它们可用于生成体内几乎任何类型的细胞。此示例展示了如何从 iPSCs 生成心肌细胞（称为心肌细胞）。为此，将 iPSCs 转移至非黏附性培养板中，使其形成类胚体，即多能干细胞的聚集体。类胚体在含有血清和抗坏血酸的特殊培养基中进行培养，后者可促进心肌分化。当部分细胞开始出现搏动时，即可直观地观察到成功的分化。

由于 iPSCs 具备分化为任何细胞类型的潜力，因此它们也能发育成完整的生物个体，例如小鼠。这一过程可通过四倍体补偿实验实现。首先，通过电场将早期胚胎的两个细胞融合，形成含有四套染色体的四倍体胚胎。该四倍体胚胎发育至囊胚阶段后，将 iPSCs 注入其中，随后将囊胚移植至受体雌性动物体内进行妊娠。四倍体细胞仅能发育为胎盘等胚外结构，因此通过该方法获得的个体完全由 iPSCs 发育而来。

一些研究人员对重编程流程进行改造，以提高对成功重编程细胞的识别效率。例如，在本实验中，利用 Oct4 启动子驱动绿色荧光蛋白（GFP）表达的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），可帮助研究人员快速识别获得多能性的细胞。

您刚刚观看了 JoVE 关于生成诱导性多能干细胞的视频。本视频回顾了该实验方法背后的原理，以及从已分化细胞生成诱导性多能干细胞（iPSCs）的逐步操作流程。我们还探讨了该方法在实验室研究中的应用与可能的改进方式。

诱导性多能干细胞的发现对干细胞生物学领域产生了深远影响，因其在开发治疗退行性疾病疗法方面具有巨大潜力。尽管在 iPSC 研究方面已取得显著进展，但仍有一个关键障碍亟待克服，即其潜在的致癌风险。目前的重编程过程可能导致细胞不受控地增殖，从而引发癌症。因此，要实现 iPSCs 的临床应用，仍需开展更多研究。一如既往，感谢您的观看！