Name: Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a técnica de clearing óptico passivo do sistema nervoso central de ratos usando modificações do protocolo CLARITY. Este método melhora a consistência e reduz custos para pesquisas em neurociência.

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Este trabalho foi generosamente apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde / Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NIH / NINDS) concessão 1R01NS086981 eo Hilton Fundação Conrad N.. Agradecemos ao Dr. Laurent Bentolila e Dr. Matthew Schibler por sua inestimável ajuda com microscopia confocal. Agradecemos a todos os que contribuíram para o fórum CLAREZA (http://forum.claritytechniques.org). Agradecemos especialmente Dr. Karl Deisseroth para a abertura de seu laboratório para ensinar essa técnica fascinante. Os autores são gratos pelo apoio generoso da Organização Mapeamento Cerebral investigação médica, fundação Mapeamento Cerebral Suporte, Pierson-Lovelace Foundation, a Fundação Ahmanson, Capital Group Companies Charitable Foundation, William M. e Linda R. Fund Filantrópica Dietel e Fundo Northstar . Pesquisa relatada nesta publicação também foi parcialmente apoiado pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e pelo Escritório do Diretor da Naçãoal Institutes of Health, com os números premiados C06RR012169, C06RR015431 e S10OD011939. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os experimentos foram realizados em conformidade com o Animal Care Institucional e diretrizes Use Committee (IACUC). THY1-YFP, PLP-EGFP e PV-TdTomato ratos foram usados ​​para estas experiências, mas nenhum camundongos que expressam proteínas fluorescentes pode ser apagada e fotografada com sucesso. 1. Preparação do Tecido Cuidado: paraformaldeído (PFA) e acrilamida são tóxicos e irritantes. Realizar experimentos utilizando estes reagentes em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos). <ol><li> Sacrificar o animal na câmara de eutanásia com ~ 1 ml de isoflurano até que a respiração cessa (~ 2-3 min). </li><li> Usar uma bomba peristáltica ajustado para ~ 5 ml / min para perfundir intracardial o rato com uma solução de perfusão (Tabela 1), a 4 ° C até que o sangue é limpo a partir de tecidos (5 - 10 min). </li><li> Alterar o perfusato a solução fixadora (Tabela 1)a 4 ° C até que o pescoço e a cauda endureceram significativamente (5-10 min). </li><li> Terminar a perfusão e decapitar o animal. Cuidadosamente dissecar o cérebro do crânio removendo primeiro o tecido conjuntivo em torno do crânio e em seguida a remoção de osso a partir da superfície ventral do crânio e o levantamento do cérebro para fora (Figura 1a), tal como descrito em 20. Nota: Dê um cuidado especial para a remoção de osso que circunda os lobos flocculonodular do cerebelo e os bulbos olfatórios. <ol><li> Dissecar a medula espinal a partir da coluna vertebral através da inserção suavemente a ponta de uma fina, tesoura afiada entre a medula espinal e a coluna vertebral e o corte dos segmentos de coluna vertebral individuais embora, tal como descrito em 21. </li></ol></li><li> Hemisect o cérebro, colocando-o numa matriz de plástico de cérebro de ratinho e de corte ao longo da linha média com uma lâmina de matriz. </li><li> Adicionar cada hemisfério e da medula espinhal para separar 50 ml banheira de centrífugaES com ~ 40 ml de solução de hidrogel (Tabela 1). A partir deste ponto tampa para a frente os tubos com folha de alumínio para proteger os fluoróforos durante todas as etapas subseqüentes. </li><li> Incubar o tubo que contém a amostra em hidrogel a 4 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 7 dias. </li></ol> 2. Polimerização <ol><li> Descartar ~ 25 ml de hidrogel, preservando a amostra e ~ 25 ml de hidrogel no tubo de centrifugação. </li><li> Desoxigena-se a amostra removendo a tampa e a colocação do tubo de centrífuga frasco em exsicador e ligar o frasco a vácuo. Aplicar vácuo durante pelo menos 10 minutos para permitir que os gases dissolvidos a sair da solução e formar bolhas. Agite suavemente para desalojar as bolhas. </li><li> Substituir o vácuo no frasco exsicador com gás de azoto a 100% durante 2-3 min. Uma vez que a pressão equaliza (uma vez que a parte superior do frasco exsicador pode ser aberto), rapidamente tampa do tubo para evitar a reintrodução de oxigénio. </li><li> Polímeroize o hidrogel através da colocação do tubo com a amostra num banho de água a 37 ° C durante 3 h até que a polimerização esteja completa. Hidrogel polimerizado irá assumir uma consistência (Figura 1b) do tipo gel. Nota: Uma pequena quantidade de hidrogel não polimerizada no topo é aceitável. </li><li> Usar uma espátula para remover a amostra polimerizada a partir do tubo de centrifugação, depois cortar o excesso de hidrogel a partir da amostra. </li><li> Remover o hidrogel restante, colocando a amostra num fiapos e limpar esfregando suavemente e rolando o tecido nele, deixando para trás apenas uma fina camada de hidrogel polimerizado na amostra. </li></ol> 3. Lipid Remoção Nota: tecido limpou-Lipid é frágil, punho com cuidado. Use um filtro de células durante a drenagem do tubo para evitar a perda de amostra. Além disso, a amostra irá inchar durante o processo de limpeza, no entanto, o inchaço pode ser invertida durante o processo de harmonização do índice de refracção. Cuidado: SodiUM sulfato de dodecilo (SDS) e ácido bórico são irritantes. Realizar experimentos utilizando-os em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos). <ol><li> Transferir a amostra polimerizada para um tubo de centrífuga de 50 ml limpos e adicionar 45 ml de tampão de compensação (Tabela 1). Incubar a 45 ° C com agitação suave (~ 30 rpm). Alterar o tampão por dia durante um período inicial de 7 dias por vazamento fora do buffer de compensação usado para resíduos químicos e adicionando ~ 45 ml de tampão de compensação fresco. Mantenha os tubos de centrífuga contendo as amostras cobertas de folha de alumínio para proteger os fluoróforos. </li><li> Após os primeiros 7 dias, incubar a amostra a C e troca de compensação tampão 40 ° a cada 2 - 3 dias. Continue compensação até que todos os lipídios são dissolvidos e tecido atinge a transparência (Figura 1c). Isto vai ser de 4 - 6 semanas para um hemisfério cerebral do rato e 2 - 4 semanas para uma medula espinal. </li><li> Uma vez que o tecido é limpo, transferiramostra para um novo tubo de centrífuga de 50 ml e lava-se 4 vezes em PBST (Tabela 1), a 40 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 24 horas para remover o SDS residual. </li></ol> 4. Coloração Molecular Cuidado: 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI) é um irritante e quaisquer experiências utilizando deve ser realizada em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos). <ol><li> Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 15 ml limpos e encher-se com 1 ug / ml de DAPI em PBST 1x, pH 7,5. Incubar à temperatura ambiente (TA) durante 24 horas. Mantenha os tubos de centrífuga contendo as amostras cobertas de folha de alumínio para proteger os fluoróforos. </li><li> Lavar 3 vezes em PBST à temperatura ambiente durante pelo menos 6 h / lavagem. </li></ol> 5. Índice de Refração Matching Cuidado: 2,2? Tiodietanol (TDE) é um irritante e quaisquer experimentos utilizando-should ser realizada em um exaustor e com equipamento adequado de proteção individual (jaleco, luvas e proteção para os olhos). <ol><li> Transferir a amostra para um tubo de centrífuga de 15 ml limpos e encher-se com 30% (v / v) em PBS 1x TDE, pH 7,5. Incubar a 40 ° C com agitação suave (~ 30 rpm) durante 24 h. </li><li> Troca TDE 30% com 63% (v / v) em PBS 1x TDE, pH 7,5. Incubar a 40 ° C com agitação suave durante 24 horas. Nota: A amostra vai encolher volta ao tamanho de aproximadamente originais. </li><li> Sobre uma superfície plana, limpo rolar um pedaço de adesivo reutilizável para um cilindro com diâmetro uniforme apenas ligeiramente maior do que a espessura da amostra. </li><li> Colocar o cilindro de adesivo reutilizável em um círculo aberto (~ 25 mm de diâmetro interno com uma pequena abertura na parte superior) em um 40 mm prato de vidro de fundo. Se correcções devem ser feitas, remover o cilindro a partir do vidro e cortado com uma lâmina de barbear. </li><li> Utilizar uma ponteira P1000 pipeta para criar um selo entre o adesivo reutilizável e vidro porrolando-o em torno do rebordo exterior do cilindro. </li><li> Lugar ~ 100 mL de 63% TDE para o prato de vidro e se espalhou para cobrir a superfície de vidro dentro do círculo de adesivo reutilizável. </li><li> Usando uma espátula, coloque cuidadosamente a amostra no meio do círculo, tomando cuidado para não formar bolhas. </li><li> Pipeta mais 100 ul de 63% TDE diretamente sobre a amostra, em seguida, coloque imediatamente a 40 milímetros circular tampa de vidro sobre o adesivo reutilizável. </li><li> Usando o indicador, médio e anelar de ambas as mãos, pressione cuidadosamente ao redor do perímetro do círculo até que a tampa de vidro fez contato com a amostra. </li><li> Lentamente trazer o fundo da placa de vidro para uma posição vertical de descanso de encontro a uma superfície, em seguida, adicionar 63% TDE com uma pipeta até que a solução atinge a pequena abertura na parte superior. Usar um cotão livre limpe para secar a ponta da pipeta de modo a que a solução não goteje sobre o vidro. Para evitar bolhas na câmara, não esvaziar a pipeta de todo o caminho. </li><li> Paraa pequena abertura, adicionar de elastómero de silicone para delimitar o círculo e criar uma câmara fechada. Espere 5 minutos para secar antes de imagem. </li></ol> 6. Microscopia Cuidado: Os lasers usados ​​em confocal, iluminação plano único e microscopia folha de luz são muito poderoso e pode causar cegueira. Quaisquer experiências utilizando lasers deve ser realizada após o treinamento extenso e com grande cuidado e proteção para os olhos adequada. <ol><li> Coloque a câmara de imagem com a amostra dentro no palco de um microscópio de varredura a laser confocal. </li><li> Abra o software de imagem (ver Tabela de Materiais). Para ligar o laser de argônio de excitação, clique na guia de configuração na parte superior do programa, em seguida, no ícone do laser. Verifique a caixa ao lado de argônio para energizar o laser e mover a escala deslizante para 30%. Observar o ponteiro lentamente aquecer para a posição seleccionada. <ol><li> Retornar à guia adquirir no topo. Na caixa grande &quot;Configurações caminho do feixe &amp;# 34; ir para a carga / salvar caixa de configuração e selecione o menu drop-down para selecionar um canal de comprimento de onda adequado para a imagem YFP (527 nm). </li></ol></li><li> Selecione objectivos adequados para imagiologia por localizar a hiperligação vermelho escrito &quot;objetivo: objeto atual&quot; abaixo da caixa de configurações do canal. Ao clicar na guia abre todos os objetivos disponíveis e uma selecção irá girar automaticamente a torre. <ol><li> Utilização objectivos (por ex., 10X), com um raio grande de trabalho (maior do que a espessura do tecido a ser visualizado, por exemplo: 11 mm) e uma grande abertura numérica (por ex., 0,3) para maximizar no plano resolução de imagem e minimizar espessura de corte óptico. </li></ol></li><li> Na coluna à esquerda da menus drop-down, abra o &quot;XY: resolução&quot; janela para definir matriz de aquisição, chamado de &quot;formato&quot;, a 1.024 x 1.024 ou um valor adequado para o limite de resolução lateral do objectivo. Defina o fator de zoom mais baixo possível (por exemplo., 10,7). </li><li> Na mesma janela, jogo 8 média de linha e um quadro de parâmetros médios por cair para baixo os menus marcados individualmente em conformidade. Use valores grandes para uma alta relação sinal-ruído e valores pequenos para a aquisição rápida. Nota: 8 médias de linha e uma média quadro vai adquirir imagens de um hemisfério do cérebro do rato de alta qualidade em aproximadamente 4 horas. </li><li> Localize a amostra usando os controles do estágio. Uma vez que um campo representativo é visível, definir o ganho e offset. Nota: O ganho e offset variará substancialmente com base no tipo de tecido, fluoróforos, e / ou característica anatômica a ser trabalhada. Para YFP, definir valores de 760-780 para o ganho e de -1,0 para -1,5 para o deslocamento. </li><li> Selecione &quot;varredura telha&quot; e selecione os limites da região de interesse. Definir os limites superior e inferior do z-stack a ser adquirido. Definir a espessura da secção óptica baseado em secção de limite de resolução óptica do objectivo. Nota: Um objetivo dolimite de resolução óptica secção é definida principalmente pela sua abertura numérica. A maioria dos softwares de controle microscópio irá calcular automaticamente um valor apropriado para o objetivo que está sendo usado. Para uma objectiva 10X com uma abertura numérica de 0,3 que seria de aproximadamente 11 uM. </li><li> Iniciar a aquisição. Nota: Isso pode demorar vários horas. </li><li> Coletar imagens de alta resolução usando objectivos maior ampliação de regiões específicas de interesse. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

clearing passiva de tecidos de hidrogel incorporado (clareza passiva) é um método simples e barato para limpar grandes pedaços de tecido. Esta abordagem não requer equipamento específico e pode ser facilmente realizada num agitador com temperatura controlada. Durante o período de algumas semanas, mesmo grandes, tecidos altamente mielinizados, como um cérebro inteiro ou medula espinhal, vai se tornar transparente e adequado para microscopia. Embora este relatório concentrou-se a limpeza de tecidos do SNC, Clareza passiva...

A capacidade de obter imagens de estruturas neuroanatômicas completas é imensamente valiosa para a compreensão do cérebro na saúde e na doença. Tradicionalmente, a imagem 3D requer seccionamento de tecido para fornecer a resolução axial e visualizar estruturas anatômicas profundas. Essa abordagem pode produzir conjuntos de dados de alta resolução, mas requer técnicas sofisticadas de reconstrução de imagens e é muito trabalhosa. Como resultado, tem sido limitado à imagem de pequenos volumes de tecido1-3. O seccionamento óptico, por outro lado, é adequado para a criação de imagens 3D de alta resolução de tecidos marcados com fluorescência. Como o seccionamento óptico é inerentemente tridimensional, não requer computação extensiva para produzir um volume de imagem 3D. No entanto, o espalhamento de luz e a opacidade do tecido limitam a profundidade na qual os tecidos podem ser seccionados opticamente. A profundidade da imagem é limitada a cerca de 150 μm na microscopia confocal de varredura a laser e a menos de 800 μm usando microscopia de excitação de dois fótons4-8.
Para superar essas limitações, várias técnicas de limpeza óptica foram desenvolvidas recentemente e depois refinadas para permitir a imagem microscópica profunda de tecidos intactos. O uso de álcool benzílico e benzoato de benzila (BABB) para tornar transparentes os tecidos fixados foi uma das primeiras abordagens9. No entanto, essa abordagem foi limitada pela extinção da fluorescência nas amostras e limpeza incompleta de estruturas altamente mielinizadas10. Refinamentos dessa técnica, como a imagem 3D de órgãos limpos com solvente (3DISCO), levaram a uma limpeza muito rápida e completa do tecido, mas ainda sofrem de perda rápida de sinais fluorescentes, especialmente a proteína fluorescente amarela (YFP) 10 . Soluções de limpeza à base de água, como Sca/e11 e SeeDB12, preservam os sinais fluorescentes, mas não limpam completamente os tecidos altamente mielinizados. Clear , Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational Analysis (CUBIC) é uma nova tecnologia de limpeza óptica promissora que parece superar as limitações das soluções de limpeza à base de água desenvolvidas anteriormente13. Em contraste com outras técnicas de limpeza óptica, o Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-hYdrogel (CLARITY)14 incorpora o cérebro em uma matriz porosa que fornece integridade estrutural a proteínas, ácidos nucléicos e pequenas moléculas, deixando os lipídios não ligados. Os lipídios são então removidos eletroforeticamente, culminando em um cérebro opticamente limpo que pode ser facilmente visualizado e igualmente facilmente sondado usando técnicas comumente disponíveis.
A limpeza eletroforética do tecido (ETC) é usada para remover lipídios de tecidos embebidos em hidrogel em CLARITY, no entanto, o ETC pode ser difícil de implementar de forma consistente e os tecidos sujeitos a eletroforese podem exibir distorção tecidual, escurecimento, perda de fluorescência e reatividade de anticorpos. A eliminação passiva de lipídios evita essas limitações, mas requer tempos de limpeza aumentados15-17. A limpeza passiva também permite a limpeza de um grande número de amostras em paralelo, uma vez que não é limitada pelo número de aparelhos ETC disponíveis. A diminuição da concentração de paraformaldeído e a exclusão da bisacrilamida do hidrogel levaram a grandes aumentos na velocidade de clareamento em detrimento de uma maior expansão tecidual16. Alternativas mais baratas para a solução de correspondência do índice de refração usada na técnica CLARITY original foram desenvolvidas17-19. O 2,2'-tiodietanol (TDE) é um agente de limpeza cerebral barato e rápido que reverte parte da expansão tecidual que ocorre durante a remoção de lipídios18. Este relatório incorpora a limpeza passiva do tecido embebido em hidrogel e o uso de TDE como uma solução de correspondência de índice de refração para a técnica CLARITY original para produzir um protocolo altamente reprodutível e barato para a limpeza óptica do sistema nervoso central do camundongo.

<table><tbody><tr><td>10x solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>tampões</td></tr><tr><td>32% paraformaldeído (PFA)</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>15714-5</td><td>perfusão e hidrogel</td></tr><tr><td>2,2'-tiodietanol (TDE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782-500G</td><td>solução de correspondência de índice de refração</td></tr><tr><td>40% acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>hidrogel</td></tr><tr><td>2% bis-acrilamida</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>hidrogel</td></tr><tr><td>VA-044 iniciador</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>hidrogel</td></tr><tr><td>ácido bórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>tampão de limpeza</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td><td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>tampão de limpeza</td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Fisher</td><td>55255-1</td><td>tampões</td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52002-100G</td><td>conservante</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500G</td><td>tampões</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>perfusão</td></tr><tr><td>Nitrato de sódio</td><td>Fisher</td><td>BP360-500</td><td>perfusão</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sondas Moleculares</td><td>D1306</td><td>coloração nuclear</td></tr><tr><td>99,9% isoflurano</td><td>Phoenix</td><td>57319-559-06</td><td>anestésico</td></tr><tr><td>Ácido clolórico</td><td>Fisher</td><td>A1445-500</td><td>tampões</td></tr><tr><td>Prato de fundo de vidro</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>Pratos Willco</td></tr><tr><td>Adesivo reutilizável</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>Elastômero de silicone</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>Toalhete sem fiapos</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>Matriz cerebral de rato</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>seccionamento de tecido</td></tr><tr><td>Lâminas matriciais</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>seccionamento de tecido</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>pefusion</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Microscopia</td><td>Leica</td><td>SP5</td></tr><tr><td>Software de imagem</td><td>Leica</td><td>LAS AF</td><td>microscopia</td></tr></tbody></table>

clearing óptica do sistema nervoso central rato usando a claridade passiva

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Tradicionalmente, a visualização do tecido exige que o tecido de interesse seja seccionado e fotografado em série, sujeitando cada seção de tecido a deformações não lineares únicas, prejudicando drasticamente a capacidade de avaliar a morfologia celular, distribuição e conectividade no sistema nervoso central (SNC). No entanto, as técnicas de limpeza óptica estão mudando a forma como os tecidos são visualizados. Essas abordagens permitem investigar profundamente as preparações de órgãos intactos, fornecendo uma tremenda visão sobre a organização estrutural dos tecidos na saúde e na doença. Técnicas como o Clear-Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) atingem esse objetivo fornecendo uma matriz que se liga a biomoléculas importantes, permitindo que os lipídios espalhados de luz se difundam livremente. A remoção de lipídios, seguida pela correspondência do índice de refração, torna o tecido transparente e prontamente visualizado em 3 dimensões (3D). No entanto, a limpeza eletroforética do tecido (ETC) usada no protocolo CLARITY original pode ser difícil de implementar com sucesso e o uso de uma solução proprietária de correspondência de índice de refração torna caro o uso rotineiro da técnica. Este relatório demonstra a implementação de um protocolo de limpeza óptica simples e barato que combina CLARITY passivo para melhorar a integridade do tecido e 2,2′-tiodietanol (TDE), uma solução de correspondência de índice de refração descrita anteriormente.

Visualizando a organização estrutural do cérebro é fundamental para a compreensão de como morfologia e conectividade afetar a função cerebral na saúde e na doença. técnicas de limpeza ópticas tornam possível a populações de células de imagem em 3D em tecidos intactos, o que nos permite estudar a morfologia e conectividade coesa. Os ratinhos que expressam proteínas fluorescentes impulsionado por promotores específicos para sub-...

As técnicas de limpeza óptica estão revolucionando a forma como os tecidos são visualizados. Neste relatório, descrevemos modificações do protocolo original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-hYdrogel (CLARITY) que produz resultados mais consistentes e menos dispendiosos.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

O objetivo geral deste protocolo é demonstrar modificações no protocolo CLARITY original, que geram resultados mais consistentes e economicamente viáveis. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na neurociência, como a morfologia tridimensional e a conectividade no sistema nervoso central. A principal vantagem desta técnica é que ela melhora a consistência do clareamento óptico e da microscopia no sistema nervoso central de camundongos.De maneira economicamente eficiente e reproduzível. A demonstração visual deste método é essencial, já que a construção da câmara de imagem é complicada e não fica clara apenas pela descrição escrita.Obtenha tecido de cérebro e medula espinhal fixado com paraformaldeído de camundongos que expressam proteínas fluorescentes. Hemicorte o cérebro colocando-o em uma matriz plástica para cérebro de camundongo e cortando ao longo da linha média com uma lâmina da matriz. Adicione cada hemisfério e a medula espinhal a tubos cónicos separados de 50 mililitros.Cada um contendo 40 mililitros de solução de hidrogel. Cubra os tubos com papel alumínio para proteger os fluoróforos. E incube os tubos contendo as amostras e o hidrogel a quatro graus Celsius com agitação suave por sete dias.Após o período de incubação, descarte 25 mililitros do hidrogel, deixando a amostra e aproximadamente 25 mililitros do hidrogel no tubo de centrífuga. Em seguida, desoxigene a amostra removendo a tampa, colocando o tubo de centrífuga em um frasco dessecador e conectando o frasco a um vácuo. Aplique o vácuo por pelo menos 10 minutos.Agite suavemente para desprender as bolhas de oxigênio liberado. Após 10 minutos, substitua o vácuo no frasco do dessecador por gás nitrogênio a 100% em dois a três minutos. Assim que a pressão se equalizar e a tampa do frasco do dessecador puder ser aberta, tampe o tubo rapidamente para evitar a reintrodução de oxigênio.A seguir, polimerize o hidrogel colocando o tubo com a amostra em um banho-maria a 37 graus celsius por três horas, até que a polimerização esteja completa. Após três horas, o hidrogel polimerizado adquirirá uma consistência semelhante à de um gel. Use uma espátula para remover a amostra polimerizada do tubo de centrífuga e, em seguida, corte o hidrogel em excesso ao redor da amostra.Por fim, remova o hidrogel remanescente colocando a amostra sobre um lenço livre de fiapos e esfregando e rolando suavemente o tecido sobre ele, deixando apenas uma fina camada de hidrogel polimerizado na amostra. Para iniciar o processo de remoção de lipídios, transfira a amostra polimerizada para um tubo de centrífuga limpo de 50 mililitros contendo 45 mililitros de tampão de clareamento e incube a 45 graus celsius com agitação suave por sete dias. Troque o tampão diariamente durante este período inicial de sete dias, despejando o tampão de clareamento usado em um recipiente para resíduos químicos.E adicionando 45 mililitros de tampão de clareamento fresco. Uma vez que todos os lipídios estejam solubilizados e o tecido atinja transparência, transfira a amostra para um novo tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 45 mililitros de PBST, e lave quatro vezes a 40 graus Celsius com agitação suave nas próximas 24 horas, para remover o SDS residual. Após a lavagem final com PBST, transfira a amostra para um tubo de centrífuga de 15 mililitros limpo contendo DAPI a um micrograma por mililitro e PBST 1x.Cubra com papel alumínio e incube à temperatura ambiente por 24 horas. No dia seguinte, lave três vezes em PBST à temperatura ambiente, com pelo menos seis horas por lavagem. Em seguida, prossiga para o ajuste do índice de refração.Para iniciar esta parte do procedimento, transfira a amostra para um tubo de centrífuga limpo de 15 mililitros contendo 2-2 tiodianol e PBS 1x em pH 7,5 e incube conforme mostrado na tela. Perto do final da segunda incubação, crie uma câmara de imagem enrolando um pedaço de adesivo reutilizável em um cilindro com diâmetro uniforme, ligeiramente maior que a espessura da amostra. Coloque o cilindro em um círculo aberto em uma placa de vidro de fundo de 40 milímetros.Em seguida, utilize uma ponteira de pipeta P1000 para criar um selo entre o adesivo reutilizável e o vidro, rolando-a ao longo da borda externa do cilindro. Pipete aproximadamente 100 microlitros de TDE 63% sobre a placa de vidro e espalhe para cobrir a superfície de vidro dentro do círculo formado pelo adesivo reutilizável. Em seguida, use uma espátula para colocar cuidadosamente a amostra no centro do círculo, tomando cuidado para não formar bolhas.Em seguida, pipete mais 100 microlitros de TDE 63% diretamente sobre a amostra e, imediatamente, coloque um lamínula circular de 40 milímetros sobre o adesivo reutilizável. Use o indicador, o médio e o anelar de ambas as mãos para pressionar cuidadosamente ao redor do perímetro do círculo até que o lamínula entre em contato com a amostra. Agora, coloque lentamente o prato com fundo de vidro na posição vertical apoiado contra uma superfície e, então, adicione TDE 63% com uma pipeta até que a solução alcance a pequena abertura no topo.Use um lenço livre de fiapos para secar a ponta da pipeta, evitando que a solução escorra sobre o vidro. Por fim, adicione elastômero de silicone à abertura pequena para fechar o círculo e criar uma câmara fechada. Aguarde cinco minutos para secagem e, em seguida, prossiga para a obtenção de imagens.Coloque a câmara de imagem com a amostra no interior sobre a platina de um microscópio confocal de varredura a laser. Abra o software de imagem; para ligar o laser de excitação de argônio, clique na aba de configuração na parte superior do programa e, em seguida, no ícone do laser. Marque a caixa ao lado de argônio para ativar o laser e mova a escala deslizante para 30%. Retorne à aba de aquisição na parte superior.Na caixa de configurações do caminho do feixe, vá até a caixa de configurações de carregamento e salvamento e selecione no menu suspenso o canal de comprimento de onda apropriado para emitir YFP. Na caixa de configurações do canal, selecione os objetivos apropriados para a aquisição de imagens clicando no hiperlink vermelho rotulado como objetivo atual. Utilize objetivos com uma distância de trabalho maior que a espessura do tecido.E uma grande abertura numérica para maximizar a resolução da imagem no plano e para minimizar a espessura da seção óptica. Na coluna esquerda dos menus suspensos, abra a janela de resolução XY para definir a matriz de aquisição, denominada formato, como 1024x1024 ou um valor apropriado para o limite de resolução lateral do objetivo. Defina o fator de zoom o mais baixo possível.1,7 é usado aqui. Na mesma janela, defina as médias de oito linhas e de um quadro ajustando os menus individualmente rotulados conforme necessário. Localize a amostra utilizando os controles do estágio.Uma vez que um campo representativo esteja visível, ajuste o ganho para entre 760 e 780 e o offset para entre 1,0 e 1,5 para YFP. Selecione a varredura em mosaico. Em seguida, defina os limites superior e inferior da pilha Z a ser adquirida.Defina a espessura da seção óptica com base no limite de resolução da seção óptica do objetivo e, em seguida, inicie a aquisição. Esta imagem mostra neurônios positivos para YFP no córtex cerebral e no hipocampo, obtidos com ampliação de 5x e reconstruídos em 3D. A barra de escala representa um milímetro.Esta projeção de intensidade máxima de uma pilha de imagens 10x do córtex cerebral demonstra a arborização dendrítica de neurônios piramidais da camada cortical cinco. Aqui, a barra de escala representa 100 micrômetros. Aqui, a expressão de THY-1YFP é mostrada em uma medula espinhal cervical e torácica intacta, obtida com ampliação de 5x e reconstruída em 3D.A barra de escala representa dois milímetros. Finalmente, esta projeção de intensidade máxima de uma pilha de imagens 10x da medula espinhal demonstra axônios individuais, as barras de escala representam 100 mícrons. Se realizada corretamente, esta técnica pode ser feita em duas a quatro semanas para medulas espinhais inteiras, e em quatro a seis semanas para hemissecções cerebrais.Após este procedimento, outros métodos, como a imunohistoquímica, podem ser realizados para responder perguntas que exigem fenotipagem bioquímica mais complexa. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como tornar transparente e imagens do sistema nervoso central de camundongo. Utilizando a clareza passiva e microscopia confocal a laser.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microscopia Multiphoton de órgãos inteiros de rato é possível através opticamente limpando o órgão antes de imagem, mas nem todos os protocolos de preservar o sinal de fluorescência de proteínas fluorescentes. Usando um método de compensação óptica com base de etanol a desidratação e álcool benzílico: benzil benzoato de compensação, que mostram imagens de alta resolução multifotônica de cérebro de rato inteiro expressando YFP.

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Hipertensão ocular crônica é induzida pelo uso de fotocoagulação a laser da malha trabecular em rato olhos. A pressão intra-ocular (IOP) é ​​elevada durante vários meses após o tratamento com laser. A diminuição da acuidade visual e sensibilidade ao contraste de animais experimentais são monitorados por meio do teste optomotor.

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Neste artigo vamos descrever o procedimento experimental completo para reconstruir, com alta resolução, a anatomia do cérebro multa de cérebros fluorescente etiquetado do mouse. O protocolo descrito inclui preparação de amostras e limpeza, espécime de montagem para a imagem latente, os dados de pós-processamento e visualização multi-escala.

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Este manuscrito descreve um protocolo para a imagem no vivo da retina do rato com a tomografia de coerência óptica de domínio espectral de alta resolução (SD-OCT). Centra-se em células ganglionares da retina (RGC) na região de peripapillary, com vários digitalização e quantificar as abordagens descritas.

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