Name: Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprenda a realizar análise eletrofisiológica de neurônios sensoriais em fatias agudas do órgão vomeronasal de camundongo. Este método utiliza gravações patch-clamp para investigar mecanismos de quimiosensação in vivo.

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Agradecemos a Ivan Rodriguez e Benoit von der Weid por gerar a linha de camundongos FPR-rs3-i-venus, suas críticas construtivas e discussões frutíferas. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Volkswagen (I/83533), da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SP724/6-1) e pela Iniciativa de Excelência dos governos federal e estadual alemães. MS é professor Lichtenberg da Fundação Volkswagen.

Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com a legislação local e da União Europeia relativa à protecção dos animais utilizados para fins experimentais (Directiva 86/609 / CEE) e com as recomendações apresentadas pela Federação das Associações de Ciência Animal Laboratório Europeu (FELASA). Ambos os ratinhos C57BL / 6 e ratinhos FPR-RS3-i-Vénus foram alojados em grupos de ambos os sexos à temperatura ambiente num 12 h ciclo de luz / escuro com comida e água disponíveis ad libitum. Para as experiências foram utilizados os jovens adultos (6-20 semanas) de ambos os sexos. Não foram observadas diferenças óbvias dependente do género. 1. Preparação de Soluções <ol><li> Preparar solução extracelular S 1: 4- (2-Hidroxi-etil) -piperazina-1-ácido etanossulf único (HEPES) tamponada solução extracelular contendo (em mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (ajustado com NaOH); osmolaridade = 300 mOsm (ajustado com glucose). </li><li> Prepare extracelluLar solução S 2: Carbogen-oxigenada (95% O2, 5% de CO 2) solução extracelular contendo (em mM) 125 de NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO4, BES 5; pH = 7,3; osmolaridade = 300 mOsm (ajustado com glucose). </li><li> Preparar a solução de agarose 4% de baixa de gelificação (S 3) para a incorporação de tecido: 4% de agarose de baixa temperatura-gelificação. Dissolve-se 2 g de agarose de baixa de gelificação em 50 ml de S 1 em 100 ml de um frasco de vidro de laboratório em conjunto com um agitador magnético. Para derreter a agarose, colocar a garrafa num banho de água (com a tampa não hermeticamente fechado) a 70 ° C durante aproximadamente 20 min ou até a solução torna-se transparente, enquanto se agitava. Arrefecer e manter a agarose fundida em um segundo banho de água a 42 ° C até à sua utilização. </li><li> Preparar solução intracelular S 4: Adição da solução de contendo (em mM) 143 KCl, 2 de KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (livre de Ca 2+ = 110 nM), 10 de HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (ajustado com KOH); osmolaridade = 290 mOsm. </li><li> Modificar / ajustar a composição de S 1, S 2, S e 4 de acordo com o desenho experimental individual (por exemplo, bloqueadores farmacológicos para isolar certos tipos de correntes activadas por tensão). </li></ol> 2. Preparação Workspace <ol><li> Preencha oxigenar câmara de fatia armazenar com S 2, pelo menos, 30 minutos antes da dissecação, colocar no gelo para ajuste de temperatura e pH e solução de oxigenar continuamente. </li><li> Encha o reservatório de superfusão fatia na configuração de gravação com S 2 e oxigenar continuamente. </li><li> Antes de dissecção, preencha vibratome de câmara com S 2 e organizar gelo picado ao redor da câmara. Em alternativa, transferir solução oxigenada de reposição de gelo frio de oxigenar câmara em vibratome câmara e manter a oxigenação continuamente. </li><li> Organizar instrumentos cirúrgicos e produtos de consumo. </li><li> Coloque pacote de gel de gelo sob dissecandomicroscópio, cubra com uma toalha de papel para evitar que o tecido VNO de congelar até a parte inferior do prato. </li><li> lâmina limpa por lavagem brevemente em 70% de etanol e água destilada e de montagem para vibratome. Substituir para cada sessão de corte. </li></ol> 3. VNO Dissection and Embedding <ol><li> O sacrifício de animais por uma breve exposição ao CO 2 e decapitar usando uma tesoura cirúrgica afiadas. Observação: Como o tempo de sacrificar o animal para colocar a cápsula VNO em gelo é crítica, minimizar o tempo de menos de 2 minutos. Para manter a viabilidade do tecido, incorporar tanto VNOs totalmente dissecada em agarose em menos de 30 min. </li><li> Remova a mandíbula inferior com grandes tesouras cirúrgicas. Entre através da cavidade bucal e cortar os ossos da mandíbula e músculos de cada lado separadamente. </li><li> Coloque a parte restante da cabeça para baixo na placa de Petri grande. </li><li> Se afastar da pele da maxila superior e em torno da ponta do nariz com uma pinça médias para obter um melhor acesso aoincisivos. </li><li> Utilize uma tesoura para cortar osso a maior parte dos incisivos a um ângulo de 45 ° ~ no sentido rostral (Figura 1A). Isto irá facilitar a remoção da cápsula VNO a partir da cavidade nasal. Nota: Não corte para a raiz do dente para evitar danos na ponta da cápsula VNO. </li><li> Pegue o palato superior rígida na sua parte rostral com uma pinça médias e cuidadosamente descascar volta em uma peça em um ângulo plano (Figura 1B). Nota: Repetidamente lavar com gelado S 2. </li><li> Use micro tesouras para cortar a mola fusão óssea entre a ponta do osso vômer e a mandíbula. Insira as pontas de tesoura com a parte curva da ponta apontando para fora longe do VNO e cuidadosamente cortar o osso em pequenos passos, tanto da esquerda e lateral direita para a cápsula VNO. </li><li> Para remover a cápsula VNO, usar tesoura micro mola para cortar através do osso vômer na parte caudal e levante cuidadosamente o osso vômer fora do ncavidade asal usando uma pinça médios. transferir imediatamente o VNO para um pequeno prato de petri sob um microscópio estéreo em um bloco de gel de gelo, onde as etapas restantes da dissecção será executada. </li><li> Enxaguar o VNO em uma pequena quantidade de gelado S 2 para evitar que o tecido seque. </li><li> Separaram-se as cápsulas que contêm os cartilaginosos tecidos moles VNO, agarrando a parte de trás do osso vômer com fórceps médias. Posicionar a cápsula para uma vista dorsal para que uma divisão entre ambos VNOs se torna visível (Figura 1D i). </li><li> Use a ponta de uma pinça fina para separar ambos cartilagem cápsulas VNO do osso central, mantendo o osso vômer fixado para baixo na parte traseira. Nota: Use uma pinça-se apenas com o rebordo da cápsula de cartilagem e ter muito cuidado de não perfurar a cartilagem como o epitélio sensorial delicado é facilmente danificada. </li><li> Uma vez que os dois VNOs são separados, começar a remover a cartilagem encapsulando os abetost VNO. </li><li> Agarre a borda superior da cápsula com uma pinça fina e se separou da parede cartilagem que foi previamente ligado ao osso vômer (lado medial). </li><li> Para remover o restante cartilagem transformar o VNO com o seu lado lateral curvado para o fundo do prato e com segurança o pino para baixo da cartilagem de um lado com a pinça. Mova cuidadosamente a segunda pinça fina do lado de trás em um ângulo muito plana entre a cartilagem e VNO para soltar a ligação entre o tecido e cartilagem. </li><li> Lentamente descascar a VNO longe da cartilagem, segurando-o em sua ponta caudal, para evitar danificar o epitélio sensorial. </li><li> Uma vez que o VNO é alavancado a partir da cápsula, certifique-se de remover todas as partes da cartilagem pequenas restantes como todos os pedaços de cartilagem irá separar o tecido circundante agarose durante o processo de corte. </li><li> Colocar uma pequena gota de gelado S 2 no primeiro VNO dissecados para evitar danos nos tecidos. Um vaso sanguíneo grande no wil lateralL se tornar visível o que indica que o órgão está ainda intacto e não foi grosseiramente danificado durante a dissecção (Figura 2A II). No caso do vaso sanguíneo ficou danificado, ainda vai valer a pena continuar com cortando o VNO, desde que a morfologia geral não foi claramente prejudicada. </li><li> dissecar imediatamente a segunda VNO. </li><li> Para incorporar a VNOs, preencha os dois pequenos pratos de Petri até a borda com S derretida 3 (armazenado em banho de água a 42 ° C; ver 1.3). </li><li> Segurar o VNO na extremidade caudal mais amplo com uma pinça fina para evitar danos ao epitélio sensorial. </li><li> Mergulha-se o VNO na agarose e movê-lo horizontalmente e para trás diversas vezes para remover a película de solução extracelular, bem como quaisquer bolhas de ar a partir da sua superfície. </li><li> Posicionar o VNO verticalmente com a ponta virada para o caudal inferior do prato. Em vez de beliscar a VNO com a pinça diretamente, ajustar a orientação, movendo a ponta fórceps em estreita proximity ao VNO. Nota: Orientação durante a incorporação é crucial, uma vez que determina plano de corte e acessibilidade aos neurônios sensoriais durante o experimento. </li><li> Coloque pratos no bloco de gelo gel e esperar até agarose solidificou. Nota: Não alterar a orientação VNO uma vez que a agarose começou a solidificar como isso irá separar o tecido do agarose circundante. </li></ol> 4. Tissue VNO Coronal Cortando <ol><li> Use pequena espátula para remover bloco de agarose do pequeno prato na tampa de uma grande placa de Petri, virar a agarose de cabeça para baixo deixando a ponta do caudal do VNO virada para cima. </li><li> Cortar o bloco em uma forma piramidal usando um bisturi cirúrgico (3-4 mm na ponta, 8-10 mm na parte inferior). Tome cuidado para não danificar o tecido incorporado. </li><li> Use super-cola para fixar o bloco em forma de pirâmide para o centro da placa de amostras vibratome e esperar ~ 1 min para a cola secar completamente. </li><li> Transferir a placa de amostra para o corte cHamber e preparar a segunda VNO, em conformidade. Mantenha a placa com a segunda amostra a 4 ° C até à sua utilização. </li><li> Use um micrótomo lâmina vibrando com as seguintes configurações: espessura: 150-200 mm; velocidade: 3.5 au = 0,15 mm / seg; frequência: 7,5 au = 75 Hz. Transfira as fatias para a câmara oxigenar até à sua utilização depois de inspecionar brevemente morfologia fatia sob o microscópio de dissecação. Fatias pode ser mantida por várias horas. </li></ol> 5. de uma única célula eletrofisiológicos Gravações <ol><li> Para as gravações, usar um microscópio de platina fixa vertical equipado com objectivos de imersão em água, ou Dodt diferencial interferir contraste infravermelho (IR-DIC), e de epi-fluorescência assim como uma câmara CCD arrefecida. Para aquisição de dados, use um amplificador de patch-clamp, palco cabeça, AD / DA placa de interface e um PC (incluindo software de gravação). </li><li> Prepare um estoque de 10-20 pipetas de patch (4-7 mohms). pipetas puxar de capilares de vidro de borosilicato (1,50 mm de diâmetro externo / 0,86 mm DI) usinga extrator micropipeta e fogo-polonês com um microforge. Nota: Fogo polir as pontas de pipeta é crucial quando remendar os bastante pequenas VSNs. Isso ajudará a impedir a ruptura da membrana celular quando a aplicação de pressão negativa, a fim de obter um selo de resistência elevada. Após o polimento da abertura da pipeta deverá ser de aproximadamente 1 uM. </li><li> Manter pipetas num frasco de armazenamento da pipeta para evitar danos e a acumulação de pó até à sua utilização. </li><li> Prepare o sistema de perfusão por encher os reservatórios de solução e tubulação acordo com o projeto experimental. Nota: Remova as bolhas de ar tubulação completamente como eles vão fortemente interferir com registros eletrofisiológicos. </li><li> Ajuste a pressão para alcançar ~ 3 min fluxo ml /. Nota: As altas pressões vão fazer com que o movimento da fatia de tecido, bem como terminação de registos electrofisiolicos. </li><li> Transferir fatia VNO a câmara de imagem e corrigir a posição fatia usando âncora de aço inoxidável com fio com 0,1 mm de espessura syntfibras hetic (Figura 2B - C). Nota: Não cubra a fatia de tecido com um dos fios de fibras sintéticas, mas sim a agarose em torno da fatia. </li><li> Câmara de imagem transferência para a gravação e configuração fatia continuamente superfuse com S oxigenado 2 à temperatura ambiente através de uma aplicação banho. </li><li> Ajustar o capilar de sucção para a superfície da solução para criar uma sucção constante lenta para a troca de solução de banho. Ajuste o 8-em-1 multi-barrel &quot;lápis de perfusão&quot; acima e perto da parte não-sensorial da fatia VNO que contém o vaso sanguíneo (Figura 2C, 3A) 50. Será benéfico para providenciar lápis perfusão e pipeta de gravação para ficar voltada para a fatia a partir de direcções opostas. </li><li> Ligue o eléctrodo de referência e uma solução de banho através de uma ponte de agar em forma de L (preenchido com KCl 150 mM). </li><li> Preencha pipeta de remendo com uma solução de pipeta S 4. </li><li> Monte a pipeta sobre o eléctrodo adesivo revestido de cloreto de prata ligado ao estágio cabeça sem raspar o revestimento e anexar firmemente. </li><li> Aplicar ligeira pressão positiva (cerca de 1 ml de uma seringa de plástico de 10 ml) para a pipeta patch antes de entrar no banho. </li><li> Abaixe a pipeta no banho usando micro manipuladores longe o suficiente para ser capaz de submergir o objetivo sem bater-lo (Figura 2D). </li><li> Monitorar a resistência da pipeta (R pip, entre 4-7 mohms) usando software eletrofisiologia ligado ao palco cabeça. Nota: Se R pip é &lt;4 mohms a ponta de vidro está quebrado. Se R pip é&gt; 10 mohms, a ponta é mais provável entupidos e da pipeta deve ser substituído. </li><li> Visualize a fatia VNO com um CCD-câmara utilizando contraste de interferência diferencial infravermelho otimizado (DIC) e identificar FPR-RS3-i-Venus células que expressam (ou semelhante neurónios marcados) usando iluminação de fluorescênciae um cubo de filtro apropriado. </li><li> Concentre-se e fluorescentes alvo ou células não-fluorescentes, dependendo do projeto experimental. </li><li> Para se aproximar do corpo celular, usar rodas de mão para o máximo de sensibilidade. Devido à pressão positiva, uma pequena mossa na membrana soma célula torna-se visível uma vez que a ponta da pipeta está em estreita proximidade. </li><li> Libertar a pressão positiva e aplicar uma ligeira pressão negativa para aspirar a membrana celular a fim de obter um selo de resistência elevada (1-20 GÊ). Aplicar sucção curto e suave para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de célula inteira. </li><li> Monitorar a resistência acesso constante durante a experiência. Nota: Inclua apenas os neurônios que apresentam pequena e estável resistência de acesso (≤3% de entrada R; mudança &lt;20% ao longo do experimento) para análise. </li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O VNO é uma estrutura quimio que detecta semioquímicos. Até à data, a maioria dos receptores vomeronasais continua a ser deorphanized como apenas pares receptor-ligando algumas foram identificadas. Entre aqueles, V1rb2 foi descrito para ser especificamente activada pela feromona urinária 2-heptanona macho 30, V2rp5 para ser activado pelo macho feromona específica esp1 57, bem como V2r1b e V2rf2 para ser activado pelos péptidos MHC SYFPEITHI 48 e SEIDLILGY 58, respectivamente. ...

A maioria dos animais dependem muito de seus sentidos químicos para interagir com os seus arredores. O sentido do olfato desempenha um papel essencial para encontrar e avaliar alimentos, evitando predadores e localização de parceiros de acasalamento adequados. Na maior parte dos mamíferos, o sistema olfactivo consiste em, pelo menos, quatro subsistemas anatomicamente e funcionalmente distintas: periféricas do epitélio olfactivo principal de 1,2, o gânglio Grueneberg 3,4, o órgão do septo de Masera 5,6 e o órgão vomeronasal. O VNO compreende a estrutura sensorial periférica do sistema olfativo acessório (AOS), que desempenha um papel importante na detecção de sinais químicos que transmitem informações sobre a identidade, sexo, classe social e estado sexual 7-10. O VNO está localizado na base do septo nasal direita acima do palato. Em ratos, que é um tubo que termina bilateral-cego contidas numa cápsula cartilaginosa 11-13. O órgão consiste em um Epítetos sensorial medial em forma de crescentelium que abriga os VSNs e de uma parte não-sensorial no lado lateral. Entre ambos os epitélios encontra-se um lúmen cheio de muco que está ligado à cavidade nasal através da conduta 14 estreita vomeronasal. Um grande vaso sanguíneo lateral no tecido não-sensorial fornece um mecanismo de bombagem vasculares para facilitar a entrada de moléculas relativamente grandes, na sua maior parte não-voláteis, tais como péptidos ou proteínas pequenas para o lúmen através VNO pressão negativa 15,16. Os componentes estruturais da VNO estão presentes no nascimento e o órgão atinge o tamanho adulto logo antes da puberdade 17. No entanto, se a AOS roedor já é funcional em juvenis ainda está sujeito a debate 18-20. VSNs distinguem-se por tanto a sua localização epitelial e do tipo de receptor de eles expressam. VSNs mostram uma morfologia bipolar com um axónio e não mielinizadas um único dendrite apical que se projecta para o lúmen e termina num botão dendrítica microvilosidades. ax VSNons fasciculate para formar o nervo vomeronasal, que deixa a cápsula cartilaginosa no final dorso-caudal, ascende ao longo do septo, passa a placa cribiforme e projetos para o bulbo olfativo acessório (AOB) 21,22. O epitélio sensorial vomeronasal consiste de duas camadas: a camada apical está localizada mais perto do lado luminal e portos tanto V1R- e todos menos um tipo de FPR-rs-expressando neurónios. Esses neurônios co-expressar o G αi2 à proteína G α-subunidade e projeto para a parte anterior da AOB 23-25. Neurônios sensoriais localizadas nas V2Rs expressas camada mais basal ou FPR-rs1 ao lado G αo e enviam seus axônios para a região posterior da AOB 26-28. Vomeronasal neurónios são activados por provavelmente bastante pequenas (29-33 semioquímicos V1Rs) ou compostos proteicos (34-38 V2Rs) que são secretadas em vários fluidos corporais, tais como urina, saliva e fluido lacrimal 37,39-41 </sup&gt;. Em experiências in situ demonstraram que VSNs também são activadas por péptidos formilados e vários compostos antimicrobianos / ligada à inflamação 25,42. Além disso, de forma heteróloga expressa proteínas FPR-R partilham espectros de agonistas com FPRs expressas no sistema imunitário, indicando um potencial papel como detectores de doença em animais da mesma espécie ou de fontes de alimentos deteriorados 25 (ver referência 43). Fundamental para a compreensão das relações receptor-ligando e cascatas de sinalização a jusante em populações específicas VSN é uma avaliação detalhada de suas características biofísicas básicas em um ambiente nativo. No passado, a análise de sinalização celular grandemente beneficiado a partir de animais geneticamente modificados que marcam uma população definida de neurónios por co-expressam uma proteína marcador fluorescente 30,44-49. Neste protocolo, uma linha de ratinhos transgénicos que expressa FPR-RS3 em conjunto com um marcador fluorescente (FPR-RS3-i-Vénus) é usado.Esta abordagem exemplifica como empregar tal estirpe de ratinhos geneticamente modificados para desempenhar análise eletrofisiológica de uma população de células opticamente identificáveis ​​utilizando único neurônio gravações de patch-clamp em coronais fatias aguda do tecido VNO. Uma pressão-driven de ar do sistema de perfusão multi-barril para estímulos sensoriais e agentes farmacológicos permite a estimulação neuronal rápida, reversível e focal ou inibição durante as gravações. gravações de célula inteira em preparações fatia permitir uma análise detalhada das propriedades intrínsecas, conductances activado tensão, bem como padrões de descarga potencial de ação no ambiente nativo da célula.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose (baixa temperatura de gelificação)</td><td>PeqLab</td><td>35-2030</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Mg-ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico (BES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td><td>de cálcio Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenoglicol tetracético (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Na-GTP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03564</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Ferramentas e consumíveis cirúrgicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri grande,</td><td>decapitação VWR de 90 mm, dissecção da cápsula</td><td>VNO</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri pequena, tampa VWR de 35 mm</td> para dissecção <td>VNO</td><td></td><td>, placa para embutir em agarose</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica grande e afiada</td><td>Ferramentas de Ciência</td><td></td> Fina <td>decapitação, remoção de mandíbula inferior</td></tr><tr><td>Tesoura de osso forte</td><td>Ferramentas</td><td>de Ciência Fina</td><td></td> cortando incisivos</tr><tr><td>Pinça média, pinça Dumont #2</td><td>Ferramentas de Ciência</td><td></td> Fina <td>removendo pele e palato</td></tr><tr><td>Tesoura de mola micro, 8,5 cm, curva, lâminas de 7 mm&nbsp;</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td></td><td>cortando VNO&nbsp;</td></tr><tr><td>Dois pares de pinças finas, pinças Dumont # 5</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>dissecando VNO fora da cápsula cartilaginosa</td></tr><tr><td>Pequena espátula de aço inoxidável</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td></td><td>manuseio de bloco de agarose e fatias de tecido</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td></td><td></td> cirúrgico <td>cortando bloco de agarose em forma piramidal</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>HEKA Elektronik</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato (1,50 mm OD/0,86 mm ID)</td><td>Science Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-câmera</td><td>Leica Microsystems</td><td>DFC360FX</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro, excitação: BP 450-490, supressão: LP 515</td><td>Leica Microsystems</td><td>I3</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada de fluorescência</td><td>Leica Microsystems</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>Agitador magnético de placa quente</td><td>Snijders</td><td>34532</td><td></td></tr><tr><td>Microforge&nbsp;</td>Dispositivo Micromanipulador <td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Luigs & Extrator</td> de micropipeta Neumann <td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>, duas etapas verticais</td><td>Narishige</td><td>PC-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Leica Microsystems</td><td>CSM DM 6000 SP5</td><td></td></tr><tr><td>Eliminador de ruído 50/60 Hz (HumBug)</td><td>Quest Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objective&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>HCX APO L20x/1.00 W</td><td></td></tr><tr><td>Osciloscópio</td><td>Tektronik</td><td>TDS 1001B</td><td></td></tr><tr><td>Osmômetro&nbsp;</td><td>Sistema de perfusão Gonotec</td><td>Osmomat 030</td><td></td></tr><tr><td>8-em-1</td><td>Medidor de pH AutoMate Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cinco jarras de armazenamento de</td> pipetas <td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td>fáceis</tr> Câmara de gravação <tr><td></td><td>e212</td><td></td><td>da World Precision Instruments</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Slice mini câmara</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear</td><td>Wilkinson Sword GmbH</td><td>Wilkinson Sword Classic</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de armazenamento de fatias oxigenantes; as câmaras comerciais alternativas são: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) ou a Pré-câmara (BSC-PC; Warner Instruments)</td> <td>microscópio estéreo personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Microsystems</td><td>S4E</td><td></td></tr><tr><td>Interface de disparo&nbsp;</td><td>HEKA Elektronik</td><td>TIB-14 S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome&nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT 1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria&nbsp;</td><td>Memmert</td><td>WNB 45</td><td></td></tr></tbody></table>

análise em profundidade physiological de populações de células definido no aguda tissue fatias do mouse vomeronasal organ

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

Na maioria dos mamíferos, o órgão vomeronasal (VNO) é uma estrutura quimiossensorial que detecta pistas sociais hetero e coespecíficas. Os neurônios sensoriais vomeronasalos (VSNs) expressam um tipo específico de receptor acoplado à proteína G (GPCR) de pelo menos três famílias diferentes de genes quimiorreceptores, permitindo a detecção sensível e específica de pistas quimiossensoriais. Essas famílias compreendem as famílias de genes V1r e V2r, bem como a família de sequências relacionadas ao receptor de peptídeo formila (FPR) (Fpr-rs) de genes quimiorreceptores putativos. Para entender a fisiologia das interações receptor-ligante vomeronasal e a sinalização a jusante, é essencial identificar as propriedades biofísicas inerentes a cada classe específica de VSNs.
A abordagem fisiológica descrita aqui permite a identificação e análise aprofundada de uma população definida de neurônios sensoriais usando uma linhagem de camundongos transgênicos (Fpr-rs3-i-Venus). O uso deste protocolo, no entanto, não se restringe a esta linha específica e, portanto, pode ser facilmente estendido a outras linhagens geneticamente modificadas ou animais do tipo selvagem.

Para obter insights sobre as propriedades biofísicas e fisiológicas de populações de células definidas, realizamos fatias de tecido coronal agudas do rato VNO (Figura 1-2). Após a dissecção, as fatias podem ser mantidos em solução extracelular oxigenado gelado (S 2) por várias horas. Na configuração de gravação, uma troca constante com solução oxigenada fresca (Figura 2D) garante a viabilidade do tecido durante todo o experime...

Aqui, descrevemos uma abordagem fisiológica que permite a identificação e análise aprofundada de uma população definida de neurônios sensoriais em fatias agudas de tecido coronal do órgão vomeronasal de camundongo usando gravações de patch-clamp de células inteiras.

Análise em profundidade Physiological de populações de células definido no aguda Tissue Fatias do mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma análise eletrofisiológica de célula única em uma população definida de neurônios sensoriais em fatias de tecido agudo do órgão vomeronasal de camundongo. Este método pode ajudar a elucidar questões fundamentais na área da quimiossensação, como os mecanismos de detecção de substâncias químicas imperceptíveis. A principal vantagem desta técnica é que, ao realizar registros de neurônios sensoriais em fatias de tecido agudo, essas células podem ser investigadas em seu ambiente nativo.Para iniciar este procedimento, após sacrificar o animal, remova sua mandíbula inferior inserindo um par de tesouras cirúrgicas grandes na cavidade bucal e corte os ossos da mandíbula e os músculos de cada lado separadamente. Em seguida, remova a pele da maxila superior e ao redor da ponta do nariz com pinça média, para obter melhor acesso aos incisivos. Depois, use a tesoura óssea para cortar a maior parte dos incisivos em um ângulo de 45 graus na direção rostral, facilitando a remoção da cápsula do VNO da cavidade nasal.Não corte a raiz do dente para evitar danos à ponta da cápsula do VNO. Em seguida, segure o palato superior rígido em sua parte rostral com uma pinça média e retire cuidadosamente em uma única peça, em um ângulo plano. Enxágue repetidamente a cavidade nasal com a solução S2 gelada. Em seguida, use tesoura microcirúrgica de mola para cortar a efusão óssea entre a ponta do osso vômer e a mandíbula.Insira as pontas da tesoura com a parte curva voltada para longe do órgão vomeronasal. E corte cuidadosamente o osso em pequenos passos em ambos os lados esquerdo e direito, lateralmente à cápsula do órgão vomeronasal. Para remover a cápsula do órgão vomeronasal, corte o osso vômer na parte caudal e levante cuidadosamente o osso vômer para fora da cavidade nasal utilizando pinça média.Transfira imediatamente o órgão vomeronasal (VNO) para uma pequena placa de Petri sob um microscópio estereoscópico sobre uma bolsa de gelo, onde os passos restantes da dissecação devem ser realizados. Em seguida, lave o VNO com uma pequena quantidade de S2 gelado para evitar que o tecido seque. Depois, separe as cápsulas cartilaginosas que contêm os tecidos moles do VNO segurando a parte posterior do osso vomer com pinça de força média.Para isso, posicione a cápsula em vista dorsal de modo que uma fissura entre os dois VNOs fique visível. Use a ponta de uma pinça fina para separar ambas as cápsulas cartilaginosas dos VNOs do osso central, mantendo o osso vômer fixo na parte traseira. Certifique-se de que a parede cartilaginosa medial, anteriormente ligada ao osso vômer, seja removida.Ao remover a cartilagem ao redor do VNO, use a pinça apenas na borda da cápsula cartilaginosa. E tenha muito cuidado para não danificar o epitélio sensorial delicado. Para remover a cartilagem remanescente, vire o VNO com seu lado lateral curvo voltado para o fundo do recipiente e fixe firmemente a cartilagem em um dos lados usando a pinça.Em seguida, mova cuidadosamente a segunda pinça fina a partir do lado posterior, em um ângulo muito rasante entre a cartilagem e o órgão vomeronasal (VNO), para soltar a conexão entre o tecido e a cartilagem. Para evitar danificar o epitélio sensorial, desprenda lentamente o VNO da cartilagem segurando-o pela sua extremidade caudal. Uma vez que o VNO tenha sido separado da cápsula, remova todas as pequenas partes restantes de cartilagem, pois quaisquer fragmentos remanescentes de cartilagem farão com que o tecido se desprenda do agarose circundante durante o processo de corte em fatias.Em seguida, coloque uma pequena gota de S2 gelada sobre o primeiro VNO dissecado para prevenir danos teciduais. Para incorporar os VNOs, encha ambos os pequenos recipientes de Petri até a borda com S3 derretido. Depois disso, imerja cada VNO em agarose e mova-o horizontalmente para frente e para trás várias vezes para remover a película de solução extracelular, bem como quaisquer bolhas de ar de sua superfície. Posicione o VNO verticalmente, com a ponta rostral voltada para o fundo do recipiente.Posteriormente, coloque ambos os recipientes sobre uma bolsa de gelo, e aguarde até que a agarose tenha solidificado. Não altere a orientação do órgão vomeronasal uma vez que a agarose tenha começado a solidificar, pois isso fará com que o tecido se desprenda da agarose ao redor. Neste procedimento, utilize uma espátula pequena para remover o bloco de agarose do recipiente pequeno para a tampa de uma placa de Petri grande, e vire a agarose de cabeça para baixo, deixando a ponta rostral do órgão vomeronasal voltada para cima.Em seguida, corte o bloco em formato piramidal usando um bisturi cirúrgico, tomando cuidado para não danificar o tecido embutido. Depois, use cola instantânea para fixar o bloco em forma de pirâmide ao centro da placa do espécime do vibrátomo. Aguarde cerca de um minuto para que a cola seque completamente.Corte o espécime em seções com espessura de 150 a 200 micrômetros. Inspecione brevemente a morfologia das seções ao microscópio estereoscópico. Em seguida, transfira todas as seções para a câmara de oxigenação até o uso.Nesta etapa, transfira uma fatia de VNO para a câmara de imagem e fixe a posição da fatia usando um suporte de aço inoxidável com fios sintéticos de diâmetro de um milímetro. Não cubra a fatia de tecido com nenhum dos fios sintéticos. Em seguida, transfira a câmara de imagem para o sistema de gravação e suprafaça continuamente a fatia com S2 oxigenado à temperatura ambiente.Ajuste a pipeta de sucção até a superfície da solução para criar uma troca constante da solução de banho. Em seguida, posicione o lápis de perfusão multibocal de oito em um acima e próximo à parte não sensorial da fatia do órgão vomeronasal que contém o vaso sanguíneo. Posteriormente, conecte o eletrodo de referência à solução de banho utilizando a ponte de ágar em formato de L preenchida com cloreto de potássio 150 milimolar.Posteriormente, preencha a pipeta de registro com a solução de pipeta S4. Monte a pipeta sobre o eletrodo revestido com cloreto de prata conectado ao estágio de cabeçote sem remover o revestimento e fixe firmemente. Em seguida, aplique uma leve pressão positiva à pipeta de registro antes de inseri-la no banho. Monitore a pipeta e certifique-se de que sua resistência esteja entre quatro megaohms e 10 megaohms.Visualize o corte do órgão vomeronasal com uma câmera CCD usando DIC otimizado para infravermelho e identifique células que expressam FPR-rs3 i-Venus ou neurônios rotulados de maneira semelhante utilizando iluminação de fluorescência e um cubo de filtro apropriado. Aproxime-se do corpo celular usando rodas manuais para máxima sensibilidade. Devido à pressão positiva, uma pequena reentrância na membrana do soma celular torna-se visível assim que a ponta da pipeta estiver em proximidade próxima.Em seguida, libere a pressão positiva e aplique uma leve pressão negativa para aspirar a membrana celular, a fim de obter um selamento de alta resistência de um a 20 gigaohms. Posteriormente, aplique sucção suave e breve para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de célula inteira. Nesta figura, uma imagem confocal de um corte coronal de tecido do órgão vomeronasal mostra a distribuição de neurônios fluorescentes positivos para FPR-rs3 Tau Venus no epitélio sensorial vomeronasal.Os neurônios positivos para FPR-rs3 Tau Venus exibem um único dendrito apical que termina em uma estrutura semelhante a um botão na borda luminar. E aqui são mostrados os registros de grampo de célula inteira realizados no soma do VSN. Abaixo estão traçados representativos de grampo de célula inteira de uma corrente de sódio rápida e ativável, sensível à TTX, em VSNs positivos para FPR-rs3.As gravações com degrau de tensão em condições de controle revelam uma corrente interna rápida e transitória dependente da tensão. O tratamento com TTX a um micromolar reduz fortemente a corrente. E o traçado subtraído digitalmente mostrado aqui revela a corrente de sódio sensível ao TTX e regulada por voltagem.Os traços representativos do clamp de corrente mostram despolarização e hiperpolarização, bem como trens de potenciais de ação gerados por injeção escalonada de corrente positiva e negativa. Uma vez dominado, todo o processo de dissecção e corte de tecido pode ser realizado em aproximadamente uma hora para ambos os VNOs. Após este procedimento, outros métodos, como gravações por patch solto extracelular ou imagem de cálcio, podem ser realizados para aumentar a produtividade ao analisar populações maiores de neurônios.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar fatias agudas de tecido do órgão vomeronasal da boca e como realizar gravações eletrofisiológicas em nível de única célula de neurônios sensoriais vomeronasais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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