Name: 나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 학습하세요 고효율 나노 PCR 기술을 이용하여 개와 말의 호흡기 병원체를 동시에 검출하는 방법을 배우세요. 이 기술은 OneHealth 감시와 수의 진단 효율성을 크게 향상시킵니다.

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여기에 설명 된 호흡기 병원체 분석에 작품은 코넬 동물 건강 진단 센터 내부 개발 기금에 의해 지원되었다. 나노 PCR 워크 플로우 및 관련 품질 보증 시스템의 개발은 부분적으로 (FOA PA-13-244) 투자와 보조금 제 1U18FD005144-에서 식품의 약국 (FDA)의 수의학 연구소 조사 및 대응 네트워크 (FDA 수의사 LIRN)와 공동으로 수행 하였다 01. 발행 수수료 VWR과 콴타 바이오 사이언스가 후원했다. 우리는 쓰고 프로토콜을 검토 그들의 도움 가브리엘 Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina 카모, XiuLin 장, Jinzhi 유, Weihua 왕, 그리고 카트리나 워커 감사합니다. 우리는 저자 인터뷰 촬영을 위해 마이크 캐롤 감사합니다. 우리는 마침내 자신의 도움이 의견 에디터 세 익명의 피어 리뷰 감사합니다.

<ol><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123(2006).</li>
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<li>Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li>
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<li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+of+Ticks%3A+The+Rule+Rather+Than+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539(2016).</li>
</ol>

마샤 슬레이터와 엘렌 Ortenberg이 문서에서 사용되는 시약 및 악기를 생산 써모 피셔 사이언 티픽 Inc.의 직원입니다.

이 절차 여섯 개월 (주 2 ~ 3 회)의 과정을 통해 우리의 실험실에서 호흡기 병원체의 일상적인 테스트를 위해 사용되어왔다. 또한 별도로 정의 접시 분변 시료 및 박테리아 균주의 장내 병원균 프로파일과 동일한 방법을 사용하여 성공이 있었다. 플레이트가 생성되면, 경험이 풍부한 직원은 하나의 표준 근무 시간 내에 2-7 단계를 완료 할 수 있습니다. 가장 중요한 단계는 프리 앰프 플레이트의 적절한 시일 (증발을 방지하기 위해 신속하게 수행되어야한다) 플레이트 사이 프리 앰프를 샘플들의 전송 및 증폭 판의 최종 덮고있다. 이 크게이 공정에 필요한 시간 및 서류의 양을 환산 결과 분석 (샘플 및 컨트롤 곡선을 확인)을위한 가이드로서 매크로 스프레드 시트의 사용은 중요 하였다. 제공되는 매크로 스프레드 시트는 예입니다; 서로 다른 구성으로 플레이트에 대한 수정 또는 재 작성 될 필요가있을 것이다. 이것은 쉽게 체육 될 수 있습니다기본 스프레드 시트 지식을 가진 사람이 rformed. 인해 증폭 판 (33 NL)에로드 시료의 미량으로 미리 증폭이 요구된다. 이 프로토콜 (미도시)의 최적화에서는 종래 증폭 마스터 믹스, 랜덤 프라이머의 첨가, 횟수, 소둔 시간, 희석 포함한 프리 앰프 파라미터의 개수를 비교 하였다. 각각의 목표는 자신의 최적의 조건을 가지고 있었고, 여기에 기술 된 우리의 패널에 대한 검색 전체의 최고 한도를 산출하는 사람들을 나타냅니다. 이 패널은 병원성 목표와 일상적인 의학적 진단 테스트에서 발생하는 샘플 종류의 넓은 범위를 커버하지만, 프리 앰프 절차에 대한 수정은 다른 패널 필요할 수 있습니다. 제조자 최적화 증폭 조건은 95 ° C에서 앤 변성이어서 95 ° C 효소 활성에서 10 분으로 표준 프로브 기반 실시간 PCR 프로토콜에 기초60 ° C에서 일링은 / 확장. 프라이머 및 프로브는 또한 미리 인쇄 제조업체 최적화 조건을 이용하여 적정하므로 필요하지 않은 판에있다. (상관없이 타겟의 종류) 모든 샘플에 대해 역전사 사전 증폭 단계를 결합함으로써 워크 플로우의 효율성을 유지하기 위해 필요했다. 모든 샘플은 전사 역 갖는 것은 또한 감도를 극대화하기위한 유용합니다. 또한 최소화 억제제에 최적화 된 프리 앰프를위한 마스터 믹스의 사용은 동일한 플레이트 상에 상이한 종류의 시료 조합에 다양성을 허용한다. 질병 통제 (CDC) 나노 리터 규모의 반응 여기 슈 등. (7)에 의해 기술 및 적응 인플루엔자 매트릭스 분석 센터는 범용 인플루엔자 인간과 반려 동물에서 테스트 샘플에 적합한 분석이다. 이것은 마이크로 리터 규모 REA을 사용하여 모든 인플루엔자 바이러스의 매트릭스 유전자의 범용 검출 설계된ctions. 그것은 CDC 인간 인플루엔자 바이러스 패널과 CDC 돼지 독감 패널의 일환으로 전 세계적으로 사용되어왔다. 여기에 적응 EHV-1 분석 8 낙태 및 신경 학적 질환 (Pusterla와 Hussey는 10 검토)를 일으킬 수 있습니다 말의 중요한 호흡기 병원체를 검출한다. 종 독립적 내부 제어와 높은 처리량 플랫폼 테스트를 적응의 의미는 그들이 OneHealth 감시 방법에 통합 될 수 있다는 것이다. 높은 처리량 테스트 플랫폼에서 이러한 분석을 모두 갖는 것은 임상 시설, 대피소 및 성능 이벤트에 대한 비상 대책을 촉진 할 것이다. 상기 결과는 분석 성능이 상당히 변화를 보였다 마이코 cynos 제외 가진 플레이트상의 모든 표적을 대표했다. 이는 이상적인 58-60 및되어야 프라이머 차선의 용융 온도 (T의 m)에 것 같았다# 176; C (이상적인 프로브 (Tm)가 68-70 °에 C)입니다. 이 플랫폼의 한계는 신속 시퀀스를 변경하는 능력을 제한 개별 프로브를 주문하는 것보다 판을 설계하고 제조하는 것이 더 오래 걸리는 점이다. 일반적으로 실시간 PCR의 다른 제한은 신규 한 또는 예기치 않은 병원체를 검출 할 수 없다는 것이다. 이것은 여러 종류의 서열과 일치 분석을 설계함으로써 어느 정도 극복 될 수 있지만, 편향 총 유전체 기반의 방법은 새로운 에이전트 발견 더 적합하다. 11,12 나노 실시간 PCR을위한 새로운 패러다임을 허용 증후군 기반의 높은 처리량 분자 진단 시약 및 노동 비용을 절감하는 데 유용 종 기반의 테스트보다는. 이 방법에 의하여 대형 패널 테스트는 던 및 Gurfield 13 Moutailler 외. (14)에 의해 기재된 것과 같은 OneHealth 감시 활동을 용이하게 할 수있다. 초기 면봉 샘플 수집,일반적으로 임상 발병 3 일 이내에, 호흡기 병원체의 존재를 확인하는 가장 좋은 기회를 제공합니다. 감염증 출현은 종종 예측 불가능하고, 시약의 변형 없이도 다른 종에 대해 수행 할 수있는 테스트가 준비 이상적이다. 이 기술의 미래 애플리케이션 pathotyping, 항생제 내성 프로파일 및 상기 신드롬 - 기반의 임상 진단 패널에있을 가능성이 높다. 나노 실시간 PCR 여러 샘플 병원체 유형의 신속한 고 처리량 스크리닝에 가장 유용하고 새로운 긴급 병원체를 식별하기위한 바이어스 또는 부분적으로 바이어스 시퀀싱 기반 접근법에 의해 보완 될 것이다.

하나의 질병에 대한 테스트중인 샘플의 많은 사용하지 않는 인간과 동물에 대한 임상 적 진단에 여러 에이전트의 신속하고 포괄적 인 검출을위한 수요, 병원균 검출을위한 단일 생물 분자 진단 방법은 부담이다. 수의학 맥락에서 높은 처리량 진단 방법으로 인해 종의 다양한 병원체를 덮는 추가의 필요에 특히 중요하다. 세균의 수를 포함하는 테스트 요구의 예는 OneHealth 식중독 질환의 관리 및 신흥 병원체 감시 접근 바이러스 (DNA 또는 RNA가 기준), 기생충, 진균. 테스트 효율을 향상시키기 위해 함께 여러 분석 (다중화)에 대한 시험을 조합하는 과제는 감도의 가능한 손실 최적화 분석법 검증 큰 부담이다. 나노 리터 규모 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 바꾼다 인많은 별도의 반응이 동일한 샘플 (1)에서 동시에 실행할 수있는 다중의 연습 네이티브. OpenArray 플랫폼은이 원리 (2)의 응용 프로그램입니다; 이는 실시간 PCR과 마이크로 어레이 기술을 결합한다. 공간 다중화의 개념에 기초하여, 모든 샘플은 관통 구멍에 분리 대상의 다수를 위해 테스트된다. 이 플랫폼은 초기에 시아닌 기반의 이중 가닥 DNA 결합 화학 2와 함께 사용과 어두운 담금질 프로브 (3)를 사용하여 프로브 기반 화학에 대해 사용할 수 있습니다했다. 이 플랫폼은 주로 인간과 동물 사 (5)에 유전 적 프로파일을 위해 사용되어왔다. 이는 최근 Grigorenko 동부 등에 의해 혈액 유래 DNA 및 RNA 병원체를 검출하도록 하였다. (6) 두 단계 역전사 / 프리 앰프 (프리 앰프) 절차를 사용. 우리는 호흡기 병원체 초에서 두 종류의 검출 여기 원스텝 프리 앰프 기반 절차를 설명retions 및 표준 근무 전적으로 수행 될 수있는 다른 종류의 시료 다양한. 한 단계의 프리 앰프가 완료되면, 샘플이 나노 PCR 플랫폼과 함께 제공되는 자동화 된 액체 처리 시스템에서 허용하는 형식입니다 384 웰 플레이트로 전송됩니다. 이 시스템은 한 번에 최대 4 판 (192 샘플 및 제어)의 표면에 걸쳐 마스터 믹스 및 샘플을 그린다. 이로드 프로세스에 따라, 우리는 샘플을 증폭 한 인쇄 된 페이지에 맞는 테이블에 각 샘플 / 대상 조합에 대한 3 기술 복제의 평균을 요약하는 매크로 스프레드 시트를 사용하여 분석하는 방법에 대해 설명합니다. 이 플랫폼을 사용하여 시료에서 추출한 DNA 및 / 또는 RNA를 분석하는 균일 한 방법이 설립되었다. 샘플의 다양한 추출 역전사 및 오류의 가능성을 최소화하는 96 웰 형식으로는 예비 증폭 하였다. 테스트 호흡 샘플은 비강 면봉, 깊은 인두 면봉을 포함,트랜스 기관 세척, 기관지 세척 및 폐 조직. 또한 말초 혈액 또는 배설물에 존재할 수있는 테스트 에이전트의 일부 있기 때문에, 우리는 절차에 샘플의 그 유형을 통합. 이 간소화 된 워크 플로우는 개별 테스트 대신에 패널 기반의 병원체 및 독소 유전자 검출을 통해 효율적인 테스트를 가능하게함으로써 여러 판에서 실험을 실행에 비해 시간과 자원을 절약 할 수 있습니다. 여기에 입증 호흡 패널 (18) 분석은 각 플레이트 당 48 샘플까지 수용, 구멍을 통해 세중 인쇄했다. 검출 된 말 병원균 말 아데노 바이러스 1 및 2, 말 동맥염 바이러스, 말 비염 바이러스 A 및 B, 말 헤르페스 바이러스 (EHV) 유형 1 (4), 스트렙토 동등 포함. 송곳니 병원체는 개 호흡기 코로나 바이러스 (betacoronavirus), 개 디스템퍼 바이러스, 개 아데노 바이러스, 개 파라 인플루엔자 바이러스, 개 pneumovirus, 보르 데 텔라 브론 키셉 및 마이코 플라즈마 cynos 포함되어 있습니다. 에이범용 인플루엔자는 분석과 내부 통제 (MS2의 RNA 파지)도 포함되었다.

<table><tbody><tr><td>Zap-OGlobin II 용해 시약</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>혈액 샘플 준비를 위한 선택적 시약.</td></tr><tr><td>추출 키트(MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>원하는 시료 유형에 적합한 다른 추출 키트로 대체할 수 있습니다. 이 키트에는 PBS, 용해 버퍼 및 세척 버퍼가 함께 제공됩니다.</td></tr><tr><td>2x One-Step RT-qPCR mix(qScript, XLT, One-Step RT-qPCR, ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>유전자 특이적 프라이머 풀</td>, <td>IDT</td><td>맞춤형 주문</td><td>: 사용자가 생성하거나 증폭 플레이트와 함께 구매할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>무작위 프라이머 믹스</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>표준 96웰 플레이트</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>이 플레이트는 기존 PCR 기계에 맞는 모든 플레이트가 될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>증폭 마스터 믹스(OpenArray 마스터 믹스)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>투명 접착 씰</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Foil seal</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>384웰 플레이트</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>증폭 플레이트(QuantStudio 12K Flex OpenArray 플레이트)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>표준 TaqMan 조건을 준수하는 모든 어세이로 맞춤화할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>액세서리 키트</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>케이스 뚜껑, 플러그 및 침수 유체가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>AccuFill 팁</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>증폭 기계(QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR 시스템)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler(OpenArray AccuFill 시스템)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>이것은 증폭 기계와 함께 구입합니다.</td></tr><tr><td>프라이머 설계 소프트웨어 (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>자세한 프라이머 및 프로브 사양은 제조업체의 지침을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>이미지 분석 프로그램(ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>스프레드시트 프로그램(Excel)</td><td>에서</td><td></td><td>사용 가능Microsoft https://products.office.com/en-us/excel</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>조직 교란기(TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>기존 열 순환기(Veriti)</td><td>에서 사용 가능Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>가열된 뚜껑이 있는 기존의 모든 열 순환기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>PCR 플레이트 스피너</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>이 장치는 단 하나의 속도(2,500rpm)만 가지고 있습니다. 로터는 뚜껑이 닫히면 시작되고 버튼을 누르면 멈춥니다.</td></tr><tr><td>TE 버퍼</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM 트리스 (하이드 록시 메틸) 아미노 메탄 염산염, 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산, pH 8.0</td></tr></tbody></table>

나노 pcr에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

나노 리터 규모의 실시간 PCR 분석은 여러 서로 반응을 조합의 전형적인 결점없이 단판에 병렬로 실행할 수 있도록하기 위해 공간 다중화를 사용한다. 우리가 고안 빠르게 급성 호흡기 질환 개와 말 일반적인 질병 인자의 존재를 식별하기 위해 본 원리에 기초 패널을 평가 하였다. 이 원고는 마이크로 리터 규모의 반응과 다른 절차에 초점을 맞추고, 샘플 준비, 증폭, 및 목표 병원체 서열 분석을위한 나노 진단 PCR 워크 플로우를 설명합니다. 제시된 호흡 패널에서 18 분석법은 각 플레이트 당 48 샘플까지 수용, 세중 년에 설립되었다. 범용 추출 사전 증폭 플로 여러 매트릭스 및 DNA 및 RNA 기반 병원균을 수용하도록 높은 처리량 샘플 제제에 대해 최적화되었다. 대표적인 데이터는 하나의 RNA 대상 (인플루엔자 A 행렬)와 하나의 DNA 대상 (말 헤르페스 바이러스에 대해 제시1). 신속하고 정확하게 병원균의 포괄적 증후군 기반 그룹을 테스트 할 수있는 능력은 효율성과 진단 테스트의 능률을 향상 급성 호흡기 질환의 진단과 관리를위한 유용한 도구입니다.

결과는 양성 대조군 및 일상적인 진단 시험에 제출 된 임상 샘플의 조합으로 대표 RNA 분석 (인플루엔자 매트릭스) 및 DNA 분석 (EHV-1)에 대한도 1 및도 2에 나타내었다. 이 일반적인 반응에 걸쳐 방출 된 형광 신호는 사이클 당 원료 형광 값을 나타내는도 1에 도시된다. 모든 상대 사이클 역치 (CT)의 값을 자동 증폭 시스템 소프트웨어에 의해 생성되었다. 배경 형광이 코네티컷 값을 계산하기 전에 형광 측정으로 통합보다는 적재 품질 평가를위한 별도의 측정을 사용한다. 각 대상에 대한 탐지의 분석 한계 (LOD)를 계산 컨트롤 풀에있는 코네티컷의 95 % 검출 레벨의 값을 더한 2 표준 편차의 전체 평균에 기반모든 대상. 복제의 적어도 95 %는 대표적인 분석법 양성인 최고 희석액 50 복제본이었다; 5 사본의 검출은 복제의 50 %에 성공했다. 어느 분석은 아래의 사본에서 검출되었다. RNA의 및 DNA 분석을위한 LOD를은 21.92과 20.05의 코네티컷의 값으로 계산 하였다. 이러한 값은 용의자 대 포지티브 (잠재적되지 반복)을보고 값에 대한 컷오프로 간주 하였다. 타겟의 분석 성능의 다른 측면은 세 가지 일 (도 2)에서 실행 풀링 양성 대조군의 희석액을 사용하여 평가 하였다. 대표 RNA 및 DNA 분석의 평균 효율은 101.1 %와 106.6 %였다; 모든 대상에 대한 전체 평균 효율은 101.3 %였다. 분석법도 좋은 선형성 (&gt; 0.98 R 2)를 가지고 있었다. 복제 내에서 변화는 관통 구멍 일반적으로 모두 임상 샘플 0.2의 표준 편차 내에하던D 제어합니다. 타겟 중간에 교차 반응은 관찰되지 않았다. 보조 파일의 최종 결과 워크 시트 (10) 임상 진단 샘플과 4 컨트롤의 대표 양적 결과를 보여줍니다. 임상 샘플은 샘플의 종류의 서브 세트는 통상적으로 비강 / 인두 면봉, 폐 조직, 분변 시료를 포함한 시험된다. 이 세트의 한 (말) 분변 샘플은 샘플 억제제의 존재를 나타내는 실패 MS2 내부 통제를 보여줍니다. 이것은 일반적으로 용출 샘플 및 / 또는 재 추출의 희석에 의해 관리됩니다. 여기의 경우와 같이, 음의 증폭 제어를 모든 타겟 제외해야하며, 음의 추출 제어는 내부 제어를 포함한다. 임상 설정에서, 샘플 betacoronavirus, 보르 데 텔라 브론 키셉, 개 디스템퍼 바이러스 A, 개 파라 인플루엔자 바이러스, 개 pneumovirus, 인플루엔자에 대한 코네티컷 값을 생성에이. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> 도 1 증폭 플롯. 형광 표시는 RNA 분석 (A) 및 DNA 분석 (B)에 대한 증폭 사이클에 대해 도시된다. 삼각형이 코네티컷 값을 나타내는 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> 그림 2. 표준 곡선. 세 가지 다른 일 테스트에서 RNA 및 DNA 분석에서 표준 곡선은 긍정적 인 컨트롤을 사용하여 증폭의 선형성과 범위를 설명하기 위해 그려진다. 사이클 임계 값 (CT) 값 RNA (A) 또는 DNA의 카피 수의 로그 (10) (에 대해 플롯 <strong&gt; B) 표준입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="1 번 테이블" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> 증폭 플레이트와 타겟 위치 표 1. 회로도.이 플랫폼 나노 실시간 PCR 시험에 사용되는 판은 현미경 슬라이드 크기 및 관통 구멍 3,072 개의 관통 구멍 (64)의 48 개의 서브 어레이로 배열되고 개별 반응합니다. 한 부분 배열은 세중의 18 목표로, 여기에 표시됩니다. 각 샘플은 액체 핸들러에 의해 하나의 부분 배열에 추가됩니다. 플레이트 표면 장력을 통해 관통 구멍의 시약을 보유하는 친수성 및 소수성 화합물로 코팅된다. 스테인레스 칩 &quot;은 포토 리소그래피 패터닝되고 3072 마이크로 머신, 320 μm의 diamete의 직선 어레이를 형성하기 위해 습식 에칭. 다음과 같이 연구 대상 33 NL 각각 &quot;2 약어의 구멍은 : BCOR, 송곳니 호흡기 코로나 (betacoronavirus) BORD, 보르 데 텔라 브론 키셉 CAV, 개 아데노 바이러스를, CPIV, 개 파라 인플루엔자 바이러스, CPNV, 개 pneumovirus, DISTA / B, 송곳니 디스템퍼 바이러스 A와 B, EADV1 / 2, 말 아데노 바이러스 2, EAV, 말 동맥염 바이러스, EHV1 / 4, 말 헤르페스 바이러스 유형 1/4, ERVA / B, 말 비염 바이러스 A / B, IVM, 인플루엔자 매트릭스; MCYNOS, 마이코 플라즈마 cynos, MS2, 내부 통제 (MS2의 RNA 파지) SEQU, 연쇄상 구균 동등. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> 표 2 플레이트 전사지도. 384 웰 플레이트의 96 웰 플레이트에서 프리 앰프에 전송하는 고정 8- 채널 피펫을 사용하는 컬러 코딩 된 전사 플레이트 맵이 도시되어있다. 대안으로, 조정 가능한 피펫이 사용될 수있다. 동일한 절차가 시간에 관계없이 매번 수행<html> 유동 많은 샘플 플레이트에 있습니다. <img alt="추가 파일" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> 추가 파일. 요약 테이블에 서식 결과 두 매크로가 포함 된 매크로 사용 스프레드 시트 파일 (프로토콜에 설명 된대로) 제공됩니다. 매크로에 의해 생성되는 전형적인 결과 테이블 (최종 결과 아래) 파일에 포함된다. 두 매크로는 샘플 이름을 첫 번째 열의 (48 샘플까지)과 긍정적 인 결과에 그들을위한 각 대상에 대한 세 가지 코네티컷 값의 평균을 작성합니다; 증폭하지 않았다 대상이 테이블에 빈 표시 있습니다. 이것은 쉽게 종이 한 장에 인쇄하고 효율적 원시 데이터를 확인하기위한 기준으로 사용될 수있다. 최종 결과 탭에서 10 임상 샘플 및 4 컨트롤에 대한 대표적인 결과가 표시됩니다. 분석 이름에 대한 요약은 표 1의 전설에 나열되어 있습니다.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

본 실시간 PCR 검사 방법론의 전반적인 목표는 DNA 및 RNA 기반 병원체를 고처리량 방식으로 동시에 검출하는 것입니다. 임상 시료의 핵산은 OpenArray 플레이트에 로딩된 공통 프라이머 풀을 통해 사전 증폭되며, 병원체의 존재 여부를 분석합니다. 이 방법은 감염병에 대한 원헬스(OneHealth) 감시 활동을 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다.전통적인 기술과 비교하여, 이 방법은 서로 간섭 없이 더 많은 표적에 대해 더 많은 샘플을 테스트할 수 있어 검사 효율성을 향상시킵니다. 이 방법에는 맞춤형 나노규모 PCR 플레이트가 사용됩니다. 프라이머와 프로브는 관통 구멍의 가장자리에 프린팅되며, 액체 핸들러를 사용하여 샘플을 로딩합니다.말과 개의 호흡기 병원체 패널을 테스트 중인 임상 시료를 사용하여 이 방법을 시연하겠습니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플레이트를 설계하십시오. 여기에서 사용된 플레이트는 18개 타겟이 3중으로 구성되어 있습니다.면봉과 기관 세척액에 배지를 추가하여 액체 부피가 최소 1~2 mL가 되도록 합니다. 튜브 내의 면봉과 DMEM을 강하게 볼텍싱합니다. 그 다음, 피펫을 사용하여 배지 약 1 mL를 새 튜브로 옮깁니다.각 비드 튜브에 235 µL의 용해 버퍼와 175 µL의 샘플을 추가합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 총 핵산을 추출하십시오. 먼저 샘플 맵을 확인한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 핵산의 역전사 및 전증폭(pre-amplification 또는 preamp)을 준비하십시오.표준 96-well 플레이트의 왼쪽 부분만을 사용하여, 각 well에 8.5 µL의 preamp master mix와 5.5 µL의 DNA/RNA 샘플을 첨가합니다. 샘플, 양성 대조군 및 음성 대조군을 preamp mix와 혼합한 후, 투명 접착 씰로 표준 96-well 플레이트를 완전히 밀봉합니다. 사이클링 도중 씰 틈새가 생기는 것을 방지하기 위해 면도날을 사용하여 과도한 씰 부분을 제거합니다.PCR 플레이트 스피너를 사용하여 밀봉된 플레이트를 20초 동안 원심분리합니다. 모든 시약이 플레이트 웰 바닥에 모였는지 확인합니다. 일반적인 써모사이클러의 전원을 켠 후, preamp 사이클링 프로그램을 선택하고 프로그램을 시작합니다.화면의 온도 표시를 모니터링하여 서모사이클러의 하단부가 cDNA 합성에 필요한 온도에 도달했을 때만 96-웰 플레이트를 서모사이클러에 넣으십시오. 프리앰프(preamp) 실행이 완료되면 플레이트의 밀봉 상태가 유지되었는지 확인하십시오. 이중 장갑과 슬리브 커버를 착용한 후, 프리앰프 플레이트에서 씰을 제거하십시오.그 다음, 겉면의 장갑을 조심스럽게 벗겨 폐기합니다. 96-웰 preamp 플레이트의 1번부터 6번 컬럼의 각 웰에 TE buffer 56 µL를 추가하고 피펫팅으로 혼합하여 preamp 생성물을 1:5로 희석합니다. 이때, 피펫의 첫 번째 정지점(first stop)까지만 누르고 바닥에서 흡입한 뒤 위쪽에서 분주하며, 기포가 생기지 않도록 주의합니다.사용하지 않는 웰에 관계없이 6개 열 모두에 TE buffer를 추가합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 증폭 플레이트로의 384-웰 전송을 준비합니다. 준비 단계가 완료되면, 크기가 잘 맞는 새 이중 장갑과 슬리브 커버를 착용합니다.소량의 시료를 피펫팅할 때 증발 속도가 빠르므로, 마스터 믹스와 샘플을 효율적으로 분주하고 즉시 플레이트를 밀봉하는 것이 매우 중요합니다. 384-웰 플레이트에 2.5 µL의 증폭 마스터 믹스를 추가하십시오. 여기서는 시연 목적으로 흰색 플레이트를 사용하였으나, 눈의 피로를 줄이기 위해 검은색 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.텍스트 프로토콜의 맵에 따라 희석된 preamp 제품 2.5 µL를 384-웰 플레이트에 분주합니다. 여기에 표시된 색상 주사위는 고정 채널 피펫의 분주 순서를 나타냅니다. 분주 직후 플레이트를 호일 씰로 단단히 덮습니다.외부 장갑과 슬리브 커버를 폐기하십시오. PCR 플레이트 스피너에서 384-웰 플레이트를 20초 동안 원심 분리하십시오. 포일 씰은 제거하지 말고, 384-웰 플레이트를 액체 핸들러에 배치하십시오.케이스에 담긴 증폭 플레이트 패키지를 열고, 시리얼 번호가 오른쪽에 오도록 액체 핸들러의 첫 번째 슬롯에 조심스럽게 배치하십시오. 이때 플레이트 표면에 닿지 않도록 케이스의 가장자리를 잡으십시오. 모든 배치가 완료되면 액체 핸들러 내부에 있는 384-웰 플레이트의 호일 씰을 제거하십시오. '다음'을 클릭한 후, 각 단계가 완료될 때마다 모든 확인란을 체크하십시오.액체 핸들러의 문을 닫고 즉시 분주 과정을 시작하십시오. 액체 핸들러 옆에서 대기하다가 플레이트 분주가 완료되면 즉시 다음 단계로 진행하십시오. 액체 핸들러가 작동하는 동안 케이스 뚜껑 바닥면의 보호 필름을 제거하십시오.상단 필름을 그대로 둡니다. 빨간색 테이프를 약간 잡아당겨 접착면에서 떼어내어 프라이밍합니다. 액체 핸들러에서 시료가 적재된 증폭 플레이트를 꺼내어 일련번호가 오른쪽에 오도록 플레이트 프레스에 조심스럽게 놓습니다.홈이 파인 끝부분이 오른쪽으로 가도록 하고 접착면이 아래로 향하게 하여 플레이트 위에 뚜껑을 덮습니다. 플레이트 프레스 레버를 조심스럽게 아래로 당겨 닫으면, 표시등이 20초 동안 깜박입니다. 이 시간 동안에는 플레이트 프레스를 만지지 마십시오.표시등이 녹색으로 점등되면 레버를 들어 올리고, 가장자리를 잡고 밀봉된 플레이트를 조심스럽게 꺼냅니다. 밀봉된 증폭 플레이트 케이스의 가장자리를 잡아 수직으로 세운 상태에서, 즉시 케이스 끝에 있는 로딩 포트에 시린지 팁을 삽입한 다음, 플레이트와 덮개 사이의 공간을 채우도록 침전액을 천천히 한 번의 부드러운 연속 동작으로 분주합니다. 플레이트가 침전된 후 모서리에 작은 기포 하나를 남겨둡니다.플레이트의 가장자리를 잡아 수직으로 유지한 상태에서, 플러그를 포트에 삽입하고 시계 방향으로 돌려 로딩 포트를 밀봉하며, 핸들이 부러질 때까지 충분한 압력을 가합니다. 에탄올을 충분히 뿌린 보풀 없는 와이프로 케이스를 닦습니다. 케이스를 건조시키려면 깨끗한 와이프로 케이스를 아래 방향으로 닦아냅니다.밀봉된 플레이트를 증폭기에 가져갑니다. 기기(instrument) 탭에서 기기 콘솔(instrument console)을 선택합니다. 증폭기를 선택한 다음 도어 열기(open door) 버튼을 클릭합니다.증폭 플레이트를 플레이트 어댑터의 첫 번째 슬롯에 넣고, 어댑터의 왼쪽 상단 모서리에 있는 1 표시가 정확하게 정렬되었는지 확인하십시오. 바코드가 위를 향하고 기기 전면을 향하도록 플레이트를 배치하십시오. 도어 닫기 버튼을 클릭한 후, 화면 하단의 홈 탭으로 이동하십시오.Run 메뉴에서 OpenArray를 선택하십시오. plate ID 가져오기를 클릭하십시오. 분석을 시작하려면 run 시작을 클릭하십시오.결과 매크로가 포함된 스프레드시트를 엽니다. 내보낸 데이터 파일에서 화면 하단의 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 이동 또는 복사를 선택하십시오. 대상 통합 문서 필드에서 결과 매크로를 선택하십시오.그런 다음 '끝으로 이동'을 클릭하고 '복사본 만들기'라고 표시된 확인란을 선택하십시오. 마지막으로 '확인'을 클릭하십시오. 기존의 export 탭을 삭제한 다음, 새로 추가된 탭의 이름을 export로 변경하십시오.보기(view)를 클릭한 다음 매크로(macros)를 선택하고, 해당 매크로를 선택한 후 실행(run)을 클릭하십시오. 다음으로 보기(view) > 매크로(macros) 순으로 클릭하여 Macro2를 선택하고 실행(run)을 클릭함으로써 Macro2에 대해서도 이 과정을 반복하십시오. 증폭기 소프트웨어 화면 왼쪽의 분석/증폭 플롯(analysis/amplification plot)을 선택하여 각 샘플과 대조군의 곡선을 매크로 표와 대조하여 확인하십시오.그 다음, 샘플 탭을 선택하고 각 샘플을 클릭하여 표의 양성 결과마다 두 개 또는 세 개의 양성 증폭 곡선이 있는지 확인합니다. 실시간 PCR이 성공적으로 수행되었음을 보여주기 위해 형광 측정값이 증폭 사이클에 따라 도식화됩니다. 대부분의 샘플은 실시간 PCR 반응의 2사이클에서 25사이클 사이에 상대적 임계값 수준에 도달했습니다.양성 대조군을 사용하여 증폭의 선형성과 범위를 입증하기 위해 서로 다른 3일에 걸쳐 수행한 표준 곡선을 도식화합니다. 사이클 임계값(Cycle threshold)을 핵산 표준물질 복제 수의 log base 10 값에 대해 도식화합니다. 두 개의 매크로가 첫 번째 열에 샘플 이름을 입력하고, 양성 결과가 나온 샘플에 대해 각 타겟별 3개 Ct 값의 평균을 입력합니다.증폭되지 않은 타겟은 이 표에서 빈칸으로 표시됩니다. 10개의 임상 시료와 4개의 루틴 대조군에 대한 정량적 결과가 표시되어 있으며, 여기서와 같이 음성 증폭 대조군은 모든 타겟에 대해 음성이어야 하고 음성 추출 대조군은 내부 대조군만 포함해야 합니다. 이 세트의 시료 중 하나는 내부 대조군이 실패한 것으로 나타나며, 이는 시료 내에 억제제가 존재함을 나타냅니다.이 영상을 시청하고 나면 나노스케일 PCR 실험을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 통해 수의 진단 분야에서 증후군 기반 패널을 더 쉽게 실행할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 감염성 질환의 원인 병원체에 대한 분석을 포함하도록 조정될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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통합 마이크로 열가소성 칩은 분자 진단으로 사용하기 위해 개발되었습니다. 이 칩은 핵산 추출, 역 transcriptase 및 PCR을 수행합니다. 제조 및 칩을 실행하기위한 방법은 설명되어 있습니다.

마이크로 유체 칩 제작 및 인플루엔자을 감지하는 방법

나노 기 공 시퀀싱은 원격 지에서 비용 효과적인 시퀀싱을 허용 하는 새로운 기술 이며 리소스 부족 설정입니다. 여기서, 우리는 이러한 조건과 호환 되는 전 혈에서 mRNAs의 시퀀싱을 위한 프로토콜을 제시 한다.

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이 문서에서는 단일 또는 벌크 C. elegans 샘플에서 유전자 발현 수준의 빠르고 신뢰할 수 있는 측정을 위한 고처리량 프로토콜이 설명되어 있다. 이 프로토콜은 RNA 절연을 필요로하지 않으며 샘플에서 직접 cDNA를 생성합니다. 고처리량 멀티플렉션 나노유체 실시간 qPCR 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다.

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이 프로토콜은 폐수 기반 역학 연구에 사용할 폐수 및 공기 샘플의 SARS-CoV-2 RNA를 정량화하고 실내 및 실외 에어로졸에서 SARS-CoV-2에 대한 노출 위험을 평가하는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 또한 SARS-CoV-2 전체 게놈 특성 분석을 위한 타일형 앰플리콘 긴 템플릿 염기서열 분석 접근법을 설명합니다.

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여기에서는 나노포어 기술을 사용하여 광견병 바이러스(RABV) 게놈을 특성화하기 위한 빠르고 비용 효율적인 워크플로우를 제시합니다. 이 워크플로우는 지역 수준에서 유전체학 정보 감시를 지원하기 위한 것으로, 광견병 통제 조치를 안내하기 위해 순환하는 RABV 계통 및 지역 계통 발생 내 배치에 대한 정보를 제공합니다.

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Microfluidic-Chip-based Loop-Mediated Isothermal Amplification을 통해 하기도 감염을 일으키는 세균성 병원체의 신속한 검출

여기에서는 증폭 준비 세포 용해, 재조합효소 중합효소 증폭 및 CRISPR/Cas12a 분석을 사용하여 Lotmaria passim 및 Nosema ceranae 와 같은 꿀벌 병원체에서 DNA를 검출하는 간단하고 빠른 절차를 설명합니다.

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나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

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