X射线荧光（XRF）
来源：Lydia Finney 博士实验室 — 阿贡国家实验室
X射线荧光是一种受激发后产生的辐射，可用于获取光谱信息。X射线荧光显微技术是一种非破坏性成像方法，利用金属受激发后产生的荧光辐射，来鉴定并定量分析其空间分布。
1. 准备氮化硅窗口
- 使用反向镊子夹取窗口片（若掉落，氮化硅窗口片会碎裂）。
- 将窗口片放置在载玻片上，平整面朝上。
- 在窗口片两侧粘贴小块透明胶带，并利用这些胶带将窗口片固定于培养皿底部。
- 用紫外辐射对培养皿中的窗口片进行灭菌。可先使用紫外交联仪的自动交联程序，随后在超净台内的紫外灯下继续照射约1小时。
2. 将细胞接种到灭菌的氮化硅窗口上
- 将培养皿倾斜约 45° 角持握。
- 用移液器沿培养皿侧边加入培养基，缓慢恢复平放，使培养基覆盖皿底表面。
- 以同样方式将细胞加入培养皿中，随后进行培养。
- 定期使用光学显微镜观察细胞，以确定其是否达到使用状态。
3. 细胞的固定与干燥
- 在超净工作台中，按照上述方法倾斜培养皿，轻柔吸除培养基。
- 加入 PBS，将移液管对准培养皿侧壁并保持倾斜角度，缓慢恢复平放，使 PBS 覆盖玻片表面。
- 轻柔吸除 PBS。
- 将培养皿倾斜，移液时对准侧壁，加入足量的 4% 多聚甲醛/PBS（pH 7）以覆盖细胞，室温固定 20 分钟。
- 移除多聚甲醛/PBS 混合液，并作为危险废物妥善处理。
- 按照上述方法加入 PBS。
- 重复步骤 3.5 和 3.6 两次。
- 轻柔吸除 PBS。
- 加入 20 mM PIPES、200 mM 蔗糖（pH 7）溶液。
- 轻柔吸除 PIPES/蔗糖溶液。
- 重复步骤 2.8 和 2.9 两次。
- 用 Kimwipe 纸迅速轻拭玻片边缘及背面凹槽，然后将玻片置于洁净表面（如橡胶网格垫）上晾干。
4. 细胞的X射线荧光成像
- 样品干燥后，使用光学显微镜检查窗口上是否存在细胞。
- 使用指甲油将窗口固定在光束线提供的铝制样品架上。
- 将铝制样品架插入运动学支架中，然后将其置于X射线显微镜光学系统的焦点位置，并使样品相对于入射X射线束呈约45°角，安装在样品纳米定位平台上。
- 离开X射线显微镜仪器区域（通常为铅墙构成的屏蔽室），打开快门，后续步骤均远程操作。
- 使用菲涅尔波带片或 Kirkpatrick-Baez 反射镜，将单色X射线束（通常能量为10 keV）聚焦至亚微米级光斑尺寸。
- 利用纳米定位样品平台，并通过预校准的下游闪烁体相机观察X射线束在样品上的位置，确定光栅扫描的合适宽度和高度，以完整采集样品数据。
- 将波长色散硅漂移探测器置于与入射束成90°角、距离样品约3 mm或更近的位置，以1–2秒的驻留时间采集测试谱。
- 观察测试谱，选择合适的扫描驻留时间，以确保目标元素获得足够的信噪比。
- 选择适当的扫描分辨率，该分辨率不应显著小于X射线束在样品上的光斑尺寸，也不应大于样品中感兴趣特征的尺寸。
- 将扫描参数输入扫描软件，并开始图像采集。
X射线荧光（XRF）光谱法是一种非破坏性分析技术，用于在室温下对样品进行元素分析。
X射线荧光（XRF）可应用于多种样品，包括生物、法医、环境样品，甚至艺术品。样品形态也多种多样，如粉末、晶体和液体。在XRF中，样品受到一束X射线轰击，从而发射出能量较低的次级X射线，称为荧光辐射。
尽管被称为荧光技术，但XRF与传统的荧光显微镜不同，因为它不使用低能量的可见光或光敏分子。
本视频将介绍XRF的基本原理，并演示如何对生物样品进行元素分布图的采集。
当一个能量足够的光子与原子碰撞时，能量被吸收，使其中一个外层电子被激发。当该电子弛豫时，会发射出一个次级光子，通常能量较低。这一过程称为荧光。与荧光显微镜中使用的低能光子不同，X射线光子的能量足够高，能够将内层紧密结合的电子完全击出。随后，一个来自较高能级的电子会跃迁至该空位。此时会释放出一个能量等于两个能级之间差值的光子。每种元素都会发射一组独特的光子，即特有的谱线，可用于识别该元素并确定其含量。这一现象被称为X射线荧光。
获取元素谱图后，可以分离出目标元素的信号。通过在样品的多个位置进行测量，逐像素生成图像，这一过程称为光栅扫描。随后可生成所有目标元素的图像。这些元素分布图可提供有关样品的宝贵信息。了解XRF原理后，您现在可以开始准备生物细胞样品，以生成元素分布图。
首先，准备并灭菌一片氮化硅窗口，该窗口将在扫描过程中固定样品。操作时需小心，因为窗口非常脆弱。将窗口朝向平面向上放置，然后将其放入培养皿中，并使用小块胶带将窗口粘附固定于培养皿上。
最后，用紫外线照射氮化硅窗口 1 小时以进行灭菌。
现在窗口已灭菌，可以将样品固定在上面。首先，将培养皿倾斜握住，从培养皿侧边加入培养基。缓慢放平培养皿，使培养基覆盖窗口。以同样方式将细胞加入培养皿中，然后进行孵育。
在使用前，定期在光学显微镜下观察细胞，直至其达到可用状态。
在超净工作台中，轻柔地吸去培养皿中的培养基。
然后，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，以去除多余的培养基。
吸弃 PBS，用多聚甲醛固定细胞。20 分钟后，移除混合液，并作为危险废物处理。
从培养皿中取出小室，用无尘纸迅速吸干小室边缘和背面凹槽处的液体。将小室置于洁净的表面上晾干。
样本干燥后，使用光学显微镜验证窗口上是否存在细胞。
使用透明指甲油将窗口固定在铝制支架上。
将样品 holder 插入仪器支架，然后将支架放置在 X 射线显微镜的定位载物台上。
将样品窗口置于X射线显微镜光学系统的焦点处，并与入射光束成45度角。
离开仪器区域，远程进行后续步骤，以尽量减少X射线暴露。
打开快门，并利用光学元件将单色X射线束聚焦至亚微米级光斑尺寸。
可通过预校准的相机对光斑位置进行成像。利用定位平台，确定在样品上进行光栅扫描所需的合适宽度和高度。
以1至2秒的停留时间采集目标元素的测试光谱。
从测试光谱中选择合适的扫描时间，以确保目标元素具有足够的信噪比。
然后，确定样品所需的分辨率。分辨率应小于感兴趣特征的尺寸，但大于光斑尺寸。最后，将扫描参数输入扫描软件，并采集图像。
在本实验中，对细胞中多种不同元素进行了元素成像分析。许多金属元素，如铜、铁和锌，是细胞内重要的营养物质，在细胞中被清晰地识别出来。
通过确定每种金属在细胞内的分布位置，可以阐明有关其正常细胞过程的重要信息。此外，还有助于理解金属相关的疾病。
X射线荧光技术被广泛应用于多个科学领域。由于XRF具有非破坏性，因此可用于历史文物的研究。艺术史学家利用该技术确定艺术品中最初使用的颜料，从而揭示作品的相关信息，例如其来源、随时间褪色的颜色以及真伪。法医科学家也在犯罪现场调查中使用XRF。当枪支发射时，周围区域会沉积枪击残留物。枪击残留物包含火药、点火底火以及弹壳和子弹中的金属成分。通过XRF获取的信息可用于识别作案人员及所用武器。
X射线荧光技术适用的另一个研究领域是古生物学。在此，从三叶虫化石中采集元素信息；三叶虫是一种生活在2.5亿多年前的海洋节肢动物。
通过表征化石的元素组成，可以获得关于早已灭绝的生命的新信息。保存更完好的样本甚至可以提供早已退化的软组织的组成信息。
您刚刚观看了 JoVE 关于 X 射线荧光的简介。您现在应该理解 X 射线光谱学的原理，以及如何从多种来源收集元素信息。
感谢观看！
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Q1: How does X-ray fluorescence differ from traditional fluorescence microscopy?
XRF uses high-energy X-ray photons that expel tightly held electrons from inner shells, whereas traditional fluorescence microscopy uses lower-energy visible light and light-active molecules. X-ray photons are energetic enough to cause inner-shell ionization, producing characteristic fluorescent radiation unique to each element that enables elemental identification and quantification.
Q2: What happens when an X-ray photon collides with an atom in XRF?
A high-energy X-ray photon expels an electron from an inner shell of the atom. An electron from a higher-energy shell then falls into the vacancy, releasing a secondary photon proportional to the energy difference between the two shells. This emitted photon is characteristic of the specific element and forms the basis of elemental identification.
Q3: What types of samples can be analyzed using X-ray fluorescence?
XRF can be applied to biological, forensic, environmental, and art samples in various forms including powders, crystals, and liquids. The non-destructive nature of XRF makes it ideal for analyzing historical artifacts, crime scene evidence, and paleontological fossils without damaging the original material.
Q4: How are elemental maps generated in XRF analysis?
Once an elemental spectrum is collected, signals of elements of interest are isolated and measured at multiple locations across a sample through raster scanning. This pixel-by-pixel process generates images for all elements of interest, producing elemental maps that reveal the spatial distribution and concentration of specific elements within the sample.
Q5: Why is sample preparation important before XRF analysis of biological cells?
Proper sample preparation ensures cells adhere securely to the silicon nitride window and remain intact during analysis. Sterilization with UV radiation, fixation with paraformaldehyde, and careful handling prevent contamination and cell damage, enabling accurate elemental mapping and reliable identification of metals like copper, iron, and zinc within cellular structures.
Q6: What information can forensic scientists obtain from XRF analysis of gunshot residue?
Gunshot residue contains gunpowder, ignition primer, and metal from the casing and bullet. XRF identifies the elemental composition of this residue, providing information that can identify the culprit and weapon used in crime scene investigations through the characteristic metal signatures present in the residue.
Q7: How does XRF contribute to understanding paleontological specimens?
By characterizing the elemental composition of fossils using XRF, researchers gain new information about long-extinct life forms. Better-preserved samples can reveal the elemental composition of soft tissues that deteriorated millions of years ago, providing insights into ancient organisms and their biological processes.