Name: LARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules ganglionnaires rétiniennes fluorescentes sans dissociation tissulaire. Cette méthode par patch-clamp permet l'analyse transcriptomique ARN monocellulaire et l'identification de marqueurs génétiques neuronaux.

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Nous souhaitons remercier Jennifer Bair et Einat Snir, ainsi que l&#39;Institut de génétique humaine de l&#39;Université de l&#39;Iowa pour leur aide à la préparation et à la gestion des échantillons.

<ol><li>Austin, C., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC40096/">Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina.</a> Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).</li>
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<li>Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+midbrain+dopaminergic+neuron+diversity+by+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Rep%22%5BJournal%5D)">Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling.</a> Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).</li>
<li>Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+Single-Cell+Isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Technologies for Single-Cell Isolation.</a> Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).</li>
<li>Lovatt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+in+vivo+analysis+%28TIVA%29+of+spatially+defined+single+cells+in+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue.</a> Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).</li>
<li>Qiu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+RNA-Seq%3A+Technical+feasibility+and+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility.</a> Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).</li>
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<li>Fuzik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+electrophysiological+recordings+with+single-cell+RNA-seq+data+identifies+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes.</a> Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+retinal+preparation+to+record+light+response+from+genetically+labeled+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells.</a> J. Vis. Exp. (47), e2367(2011).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Function+of+Bistratified+Intrinsically+Photosensitive+Retinal+Ganglion+Cells+in+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse.</a> J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).</li>
<li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cone+pathway+influence+on+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cell+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes.</a> J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).</li>
<li>Clontech Laboratories I. <a target="_blank" href="http://www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=41709">SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing</a>. , (2013).</li>
<li>Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+RNA-Seq+libraries+for+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).</li>
<li>Ecker, J. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20624591">Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision.</a> Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).</li>
<li>Schmidt, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+Melanopsin+in+Alpha+Retinal+Ganglion+Cells+and+Contrast+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection.</a> Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).</li>
<li>Sanes, J. R., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Types+of+Retinal+Ganglion+Cells%3A+Current+Status+and+Implications+for+Neuronal+Classification%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification.</a> Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).</li>
<li>Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Profiling+of+Developing+and+Mature+Retinal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e3824(2012).</li>
<li>Trimarchi, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Heterogeneity+of+Developing+Retinal+Ganglion+and+Amacrine+Cells+Revealed+through+Single+Cell+Gene+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling.</a> J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Notre protocole démontre, par un guide rapide et facile à utiliser, une méthode pour préparer des cellules individuelles de classes morphologiques identifiées pour un séquençage de haute qualité, avec peu de blessures à l&#39;échantillon. Dans le présent manuscrit, les cellules ganglionnaires de la rétine intrinsèquement photosensibles sont morphologiquement caractérisées, isolées et préparées pour l&#39;ARN-Seq. Des contraintes cellulaires peuvent se produire pendant la manipulation de la rétine; Pour cette raison, nou...

La diversité neuronale est observée dans tout le système nerveux central, en particulier dans la rétine des vertébrés, un tissu hautement spécialisé constitué de 1 type de cellules gliaires et 6 neuronales provenant d&#39;une population de cellules progénitrices rétiniennes 1 , 2 , 3 . De nombreux sous-types de cellules peuvent être classés fonctionnellement, morphologiquement et génétiquement. Le but de ce protocole est de lier la variabilité génétique des types de cellules à leurs caractéristiques fonctionnelles et / ou morphologiques identifiables. Un certain nombre de gènes ont été identifiés pour la classification des cellules, mais de nombreux sous-types continuent à ne pas caractériser, car ils représentent une petite fraction de la population globale. L&#39;identification des gènes dans ces sous-types spécifiques permettra une meilleure compréhension de la diversité neuronale au sein de la rétine et peut également éclairer la diversification des cellules neuronales ailleurs. FuDe plus, les études à une seule cellule permettent de découvrir de nouveaux types de cellules, ce qui pourrait avoir été négligé en raison de leur faible représentation parmi la population générale 4 , 5 , 6 , 7 . L&#39;un des avantages de la transcriptomie monocellulaire est que des marqueurs uniques ou des combinaisons de marqueurs qui définissent un sous-type cellulaire particulier peuvent être découverts. Ceux-ci peuvent ensuite être utilisés pour obtenir un accès génétique à ce type de cellule pour différentes manipulations. Par exemple, nous utilisons ce protocole pour caractériser les gènes spécifiques du type cellulaire d&#39;un sous-ensemble de cellules ganglionnaires rétiniennes qui expriment le photopigment de la mélanopsine. L&#39;utilisation d&#39;un marqueur fluorescent dans des cellules ganglionnaires rétiniennes exprimant la mélanopsine permet d&#39;étudier ces cellules car elles sont regroupées en raison de leur expression d&#39;un gène connu. Fait intéressant, il existe cinq sous-types connus de cette popu cellulaireDans la retine de la souris 8 . Ainsi, pour isoler l&#39;ARN des cellules de chaque type, nous avons utilisé des classifications morphologiques établies dans le modèle transgénique pour identifier chaque sous-type avant l&#39;isolement cellulaire. Cette technique permet la caractérisation des cellules ainsi que leur isolement directement à partir de la rétine, sans nécessiter de dissociation tissulaire, ce qui peut provoquer une réponse au stress dans les cellules et la contamination due à des dendrites coupées 9 . Une multitude de nouvelles techniques sont apparues au cours des dernières années alors que la méthode RNA-Seq continue de se développer. Ces outils permettent une acquisition maximale des cellules et une plus grande rentabilité tout en abordant la question à l&#39;étude 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Cependant, pendantCes techniques ont été d&#39;excellents tremplins, il existe un certain nombre d&#39;obstacles encore rencontrés que ce protocole peut traiter. Tout d&#39;abord, bon nombre des procédures actuelles isolent les cellules du tissu dissocié et tentent d&#39;utiliser soit l&#39;analyse des composants principaux, soit le regroupement hiérarchique post-hoc pour déterminer la classification des cellules. S&#39;appuyer sur ces outils pour classer les sous-types peut ne pas produire de résultats fiables et peut forcer l&#39;un à trouver de nouvelles façons de valider ces données pour la corrélation d&#39;un marqueur génétique avec un type de cellule fonctionnelle. L&#39;exigence de dissociation dans d&#39;autres protocoles peut parfois entraîner des lésions tissulaires et peut entraîner la rupture des processus neuronaux, entraînant une perte potentielle d&#39;ARNm. En outre, dans les préparations de cellules dissociées, les réponses au stress peuvent commencer à affecter les transcriptomes de ces cellules 14 . Ce protocole surmonte ces défis en déterminant le type de cellule fonctionnelle avant l&#39;isolement, et il maintient mieux le hLa santé des cellules en gardant le tissu rétinien intact. Une technique a été introduite en 2014 et consistait en l&#39;analyse in vivo du transcriptome des cellules vivantes 15 . Bien que cette technique permette l&#39;examen du transcriptome avec une rupture mécanique minimale du tissu, il manque la capacité de classer les types de cellules spécifiques dans le tissu avant d&#39;examiner leurs transcriptomes sans utiliser une souris journaliste très spécifique. Notre protocole ne nécessite pas de journaliste spécifique, car nous utilisons le remplissage cellulaire et l&#39;électrophysiologie pour caractériser les cellules avant leur isolement. Une autre limitation de ce protocole précédent est qu&#39;il nécessite une longueur d&#39;onde spécifique pour exciter l&#39;élément photoactivable, alors que notre protocole permet l&#39;utilisation d&#39;un reporter fluorescent et d&#39;un colorant fluorescent, qui sont facilement disponibles ou peuvent être choisis par chaque laboratoire individuellement. Pourtant, d&#39;autres laboratoires ont épousé les deux méthodes de l&#39;électrL&#39;ophysiologie et la transcriptomie pour l&#39;étude de la diversité cellulaire. L&#39;utilisation d&#39;enregistrements patch-clamp pour caractériser la fonction d&#39;une cellule avant son isolement a été réalisée sur des neurones dissociés 16 et, dans certains cas, elle a précédé l&#39;utilisation de l&#39;analyse par microarrays 17 pour ces études. Les mêmes complications sont rencontrées par ces approches, car elles nécessitent une dissociation des tissus ou l&#39;utilisation de la technologie des microarray, qui repose sur l&#39;hybridation des échantillons sur les sondes disponibles. L&#39;un des progrès les plus récents a été le développement de Patch-Seq, une technique qui combine l&#39;utilisation des enregistrements de patch-clamp et de la technologie RNA-Seq pour comprendre les cellules des tranches de cerveau entier 18 . Bien que cette technique ait ses similitudes avec le protocole présenté ici, il est à nouveau important de noter que notre approche permet au tissu de rester intact pour la santé des cellules. Ici, nous présentons un protocole pour l&#39;optimisationDe cette alliance, qui génère des bibliothèques à une seule cellule de haute qualité pour l&#39;utilisation d&#39;ARN-Seq pour obtenir une profondeur de lecture et une couverture de cartographie élevées.

<table><tbody><tr><td>Ames' Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1420-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate</td><td>Spectrum Chemical</td><td>PO178</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Hydrazide</td><td>Invitrogen</td><td>A10442</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Worthington Biochimique&nbsp ;</td><td></td><td></td>LS005273</tr><tr><td>hyaluronidase</td><td>Worthington Biochimique&nbsp ;</td><td></td><td></td>LS002592</tr><tr><td>Boîte de Pétri (35 mm de diamètre)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux ophtalmologiques</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pince</td><td>pour les sciences fines</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de microplaques</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-687-708</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette en verre</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette</td><td>Sutter</td><td></td><td>P-1000 extracteur de pipette horizontal</td></tr> 1 <tr><td>mL seringue</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2F</td><td></td></tr><tr><td>Tube flexible</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171</td><td></td></tr><tr><td>TCL tampon de lyse</td><td>Qiagen</td><td>1031576</td><td>Tampon de lyse 1</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans RNase</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>0,2 mL Tubes PCR</td><td>Eppendorf</td><td>30124359</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique, Pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td>Ethanol</td></tr><tr><td>Analog Vortex</td><td>Mixer Thermo Fisher Scientific</td><td>02215365</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Mini Centrifugeuse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63987</td><td>Perles magnétiques d’ARN</td></tr><tr><td>MagnaBlot II Séparateur magnétique</td><td>Promega</td><td>V8351</td><td>Support magnétique</td></tr><tr><td>1,5 mL MCT Tubes gradués</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Smart-Seq v4 Kit d’ARN à très faible entrée</td><td>Clontech</td><td>634888</td><td>réactifs pour la transcription inverse et l’amplification PCR</td></tr><tr><td>10x Tampon</td><td></td> <td>de lyse</td><td>Tampon de lyse 2</td></tr><tr><td></td>5x Tampon <td></td><td></td><td>de premier brin ultra faible</td> 1</tr><tr><td>3' SMART-Seq CDS Primer II A</td><td></td><td></td><td>Primer II</td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Oligonucléotide</td><td>Oligonucléotide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMARTScribe Rverse Transcriptase Transcriptase</td><td></td><td></td><td>inverse (RT)</td></tr><tr><td>2x SeqAmp PCR Buffer</td><td></td><td></td><td>PCR Buffer</td></tr><tr><td>PCR Primer II A</td><td></td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Primer SeqAmp DNA Polymerase</td><td></td><td></td><td>DNA Polymerase</td></tr><tr><td>Mastercycler pro S</td><td>Eppendorf</td><td>950030020</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td> DNA magnetic <td>beads</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>HS Bioanalyzer Chips & Réactifs</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>Pour le calcul des concentrations d’échantillons</td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>Réactifs pour le marquage et le couplage d’indices</td></tr><tr><td>Tampon TD</td><td></td><td></td><td>Tampon 2</td></tr><tr><td>ATM</td><td></td><td></td><td>Tagmentation</td></tr> Mix NT <tr><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>de neutralisation de marquage</td></tr><tr><td>NPM</td><td></td><td></td><td>PCR Master Mix</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>Indices pour Tagmentation</td></tr><tr><td>N501</td><td></td><td></td><td>Blanc 1</td></tr><tr><td>N502</td><td></td><td></td><td>Blanc 2</td></tr><tr><td>N701</td><td></td><td></td><td>Orange 1</td></tr><tr><td>N702</td><td></td><td></td><td>Orange 2</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td>Pour compléter le séquençage des échantillons</td></tr></tbody></table>

l&#39;arn monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

La découverte de marqueurs spécifiques de type cellulaire peut donner un aperçu de la fonction cellulaire et des origines de l&#39;hétérogénéité cellulaire. Avec une poussée récente pour une meilleure compréhension de la diversité neuronale, il est important d&#39;identifier des gènes dont l&#39;expression définit diverses sous-populations de cellules. La rétine sert d&#39;excellent modèle pour l&#39;étude de la diversité du système nerveux central, car elle est composée de multiples types de cellules majeures. L&#39;étude de chaque classe majeure de cellules a donné des marqueurs génétiques qui facilitent l&#39;identification de ces populations. Cependant, de multiples sous-types de cellules existent dans chacune de ces principales classes de cellules rétiniennes, et quelques-uns de ces sous-types connaissent des marqueurs génétiques, même si beaucoup ont été caractérisés par une morphologie ou une fonction. Une connaissance des marqueurs génétiques pour les sous-types individuels de la rétine permettrait l&#39;étude et la cartographie des cibles cérébrales liées à des fonctions visuelles spécifiques et pourrait également donner un aperçu des réseaux génétiques quiMaintenir la diversité cellulaire. Les avenues actuelles utilisées pour identifier les marqueurs génétiques des sous-types présentent des inconvénients tels que la classification des types de cellules suite au séquençage. Cela présente un défi pour l&#39;analyse des données et nécessite des méthodes de validation rigoureuses pour s&#39;assurer que les grappes contiennent des cellules de même fonction. Nous proposons une technique pour identifier la morphologie et la fonctionnalité d&#39;une cellule avant l&#39;isolement et le séquençage, ce qui permettra une identification plus facile des marqueurs spécifiques aux sous-types. Cette technique peut être étendue aux types de cellules non neuronales, ainsi qu&#39;à des populations rares de cellules présentant des variations mineures. Ce protocole produit des données d&#39;excellente qualité, car de nombreuses bibliothèques ont fourni des profondeurs de lecture supérieures à 20 millions de lectures pour des cellules individuelles. Cette méthodologie remédie à plusieurs des obstacles présentés par les cellules monocellulaires RNA-Seq et peut être adaptée pour les chercheurs visant à faire connaître les types de cellules d&#39;une manière simple et efficace.

Les types de cellules sont facilement classés à la suite de l&#39;injection de colorant La figure 1 montre un exemple de GFP + RGC avant et après le remplissage du traceur fluorescent. Cette cellule a été identifiée en fonction de son expression de GFP dans la ligne transgénique ( figure 1A ). Une étanchéité étroite a été formée avec une électrode de verre à pointe fine sur le soma de cette cellu...

Ici, nous présentons une approche combinatoire pour classer les types de cellules neuronales avant l&#39;isolement et pour la caractérisation ultérieure des transcriptomes monocellulaires. Ce protocole optimise la préparation d&#39;échantillons pour un séquençage d&#39;ARN réussi (RNA-Seq) et décrit une méthodologie conçue spécifiquement pour une meilleure compréhension de la diversité cellulaire.

L&#39;ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules uniques marquées par fluorescence à partir de rétines entières vivantes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences, telles que le nombre de sous-types appartenant à une classe neuronale particulière et quels sont les marqueurs génétiques pour chacun de ces sous-types ?Le principal avantage de cette technique est que nous évitons la nécessité de dissocier le tissu rétinien, permettant ainsi aux cellules de survivre dans un environnement plus sain avant leur isolement. Les implications de cette technique s'étendent à toute population cellulaire marquée par fluorescence et peuvent donc être appliquées à d'autres systèmes afin de comprendre la diversité cellulaire et la fonction cellulaire dans la santé et la maladie. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car cette technique dépend de la capacité du chercheur à réaliser un enregistrement en configuration patch-clamp sur une cellule sans compromettre sa viabilité.La démonstration future de cette méthode est essentielle, car les étapes d'isolement de l'ARN peuvent être difficiles à apprendre, étant d

single-cell-rna-seq-of-defined-subsets-of-retinal-ganglion-cells

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Cet article fournit une description de la manière de disséquer et d'enregistrer à partir de la préparation isolée de la rétine chez la souris. En particulier, nous décrivons comment enregistrer les réponses de lumière provenant d'une population de cellules ganglionnaires marqués par fluorescence et par la suite identifier et d'analyser sa morphologie.

Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

Procédé pour l'isolement de cellules rétiniennes uniques et d'amplification ultérieur de leurs ADNc est décrite. Monocellulaires transcriptomique révèle le degré de l'actuelle hétérogénéité cellulaire dans un tissu et découvre de nouveaux gènes marqueurs de populations de cellules rares. Le protocole d'accompagnement peut être ajustée en fonction de nombreux types cellulaires différents.

Une seule cellule de profilage de développer et d&#39;âge mûr neurones de la rétine

Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules ganglionnaires primaires de la rétine (CGR) murines à l’aide de la cytométrie en flux. Cette méthode permet l’étude future des CGR, dans le but de mieux comprendre le déclin majeur de l’acuité visuelle qui résulte de la perte des CGR fonctionnels dans les maladies neurodégénératives.

Isolement de cellules ganglionnaires rétiniennes murines à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence

Source : Laboissonnière, et. al. Séquençage de l’ARN unicellulaire de sous-ensembles définis de cellules ganglionnaires rétiniennes. J. Vis. exp. (2017).  Cette vidéo présente une technique de traçage par fluorescence pour identifier les sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans une rétine de souris transgénique. Le processus consiste à fixer la rétine isolée dans une chambre d’enregistrement, à maintenir la viabilité cellulaire grâce à une perfusion oxygénée et à cibler les...

Identification de sous-types de cellules ganglionnaires rétiniennes de souris par traçage fluorescent

Nous avons utilisé des échantillons de la rétine rétinectomie pour une analyse transcriptomique de décollement de la rétine. Nous avons développé une procédure qui permet la conservation d'ARN entre les blocs opératoires et les laboratoires. Nous avons standardisé un protocole pour purifier l'ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s'assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l'analyse des microréseaux.

L&#39;analyse transcriptomique de prélèvements rétine humaine en utilisant Journal

protocoles d'immunohistochimie sont utilisées pour étudier la localisation d'une protéine spécifique de la rétine. Les techniques d'imagerie de calcium sont utilisés pour étudier la dynamique du calcium dans les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones.

Immunohistochimie et calcium méthodes d&#39;imagerie dans Wholemount Rat Retina

Des millions de personnes souffrent de maladies dégénératives de la rétine qui entraînent une cécité irréversible. Un élément commun de nombreuses de ces maladies est la perte de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Ce protocole détaillé décrit l'isolement des RGC murins primaires par sélection positive et négative avec cytométrie de flux.

Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

Ici, les auteurs démontrent l’utilité de MULTI-seq pour le phénotypage et les scRNA-seq et scATAC-seq appariés ultérieurs dans la caractérisation des profils d’accessibilité transcriptomique et chromatine dans la rétine.

Analyse multiplexée de l’expression génique rétinienne et de l’accessibilité de la chromatine à l’aide de scRNA-Seq et scATAC-Seq

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes postnatales murines optimisées pour le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Ces cellules conviennent aux approches de séquençage de nouvelle génération.

Isolement de cellules endothéliales rétiniennes murines pour le séquençage de nouvelle génération

La rétine présente une organisation spatiale complexe à travers sa structure laminaire. Les techniques modernes de transcriptomique spatiale et de séquençage nécessitent des coupes de tissus &lt; 20 μm d’épaisseur, ce qui limite leur applicabilité à la recherche rétinienne. Cette méthode de cryosectionnement fraîchement congelée produit de fines sections de la rétine de la souris tout en préservant les relations spatiales planes, permettant une cartographie moléculaire complète à travers les...

En face Cryosectionnement de la rétine de souris pour l’analyse moléculaire spatiale de haute dimension

Découvrez l'isolation de cellules ganglionnaires rétiniennes fluorescentes sans dissociation tissulaire. Cette méthode par patch-clamp permet l'analyse transcriptomique ARN monocellulaire et l'identification de marqueurs génétiques neuronaux.

L'ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes

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