遗传筛选
遗传筛选是确定基因功能和理解基因相互作用的关键工具。筛选通常包括对基因进行突变，然后评估受影响生物体的相关表型。该过程可以是“正向遗传学”方法，即随机产生突变以鉴定导致特定表型的未知基因；也可以是“反向遗传学”方法，即针对特定基因进行突变，以观察所产生的表型。
本文中，JoVE 将回顾多种类型的遗传筛…
基因筛选是鉴定导致特定表型的基因和突变的重要工具，也有助于理解基因在生物过程中的功能。基因筛选可在多种模式系统中进行，包括果蝇、线虫、植物和细胞培养，这些研究已帮助发现了新的细胞通路以及人类疾病的潜在药物靶点。
本视频将概述不同类型的基因筛选方法，介绍在线虫中进行基因筛选的两种通用实验方案，并展示当前实验室中基因筛选的一些应用实例。
首先，让我们了解一下什么是遗传筛选以及我们能从中获得哪些信息。
遗传筛选基于正向遗传学或反向遗传学。在正向或“经典”遗传筛选中，使用辐射或称为诱变剂的化学物质在生物体的DNA中随机产生突变。此外，还可以通过插入额外的碱基对来实现突变，例如利用被称为转座子的序列，这些序列可整合到基因组的不同位置，并破坏其插入基因的功能。这类插入通常与荧光报告基因偶联，以便直接检测突变生物体。当发现某个突变体表现出感兴趣的表型时，即可将该未知突变基因定位至染色体并进行测序。
与之相反的方法是反向遗传筛选，研究人员在此过程中干扰多个候选基因的表达，然后观察这些操作所导致的突变表型。
除了破坏基因活性的“功能缺失”突变外，遗传筛选也可基于“功能获得”突变，即导致基因表达水平或功能增强的突变。这可以通过将基因调控元件随机插入基因组中实现，这些元件会驱动其上游插入基因的过量表达。
另一种方法称为“表达筛选”，研究人员利用包含多种基因编码序列的质粒文库，将其导入细胞中，使这些基因在细胞内高水平表达。随后可通过分析产生的表型来理解基因功能。
为了进一步了解已知基因或突变的更多信息，可采用修饰因子筛选。抑制子筛选从一个特征明确的突变体出发，寻找能够使该突变体表型减轻的额外突变。若发现的抑制子突变位于与原始突变相同的基因内，则称为“基因内抑制”；若位于不同基因中，则称为“基因间抑制”。
相比之下，增强子筛选则用于鉴定加剧突变表型严重程度的额外突变。这类筛选有助于确定具有冗余性或可能存在功能相互作用的基因。当两个或多个突变组合导致生长严重受损甚至死亡时，这种情况被称为“合成致死或合成病态”。针对合成致死或合成病态突变的筛选可揭示在冗余但至关重要的生物学通路中发挥作用的基因。例如，在识别多个可同时作为药物靶点以杀死癌细胞的基因产物方面，这种方法尤为有用。
了解了一些常见的遗传筛选策略后，接下来我们来看一下在一种常用的模式生物——线虫中进行正向筛选的一般实验流程。
本示例中将使用甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate, EMS）进行化学诱变。EMS通过化学修饰鸟嘌呤核苷酸，使其在后续的DNA复制过程中错误地与胸腺嘧啶配对。由于EMS是一种诱变剂且可能具有致癌性，操作时必须佩戴双层手套，并在通风橱内进行。
首先，选取大量处于末期幼虫阶段的线虫，经洗涤后收集。将EMS加入线虫中，孵育数小时以诱导突变。诱变处理后，需去除线虫中的EMS，并用氢氧化钠将其灭活。随后，用培养基多次洗涤线虫，并将其接种至琼脂平板上。
接着，挑选外观健康的线虫转移至新制的、接种了细菌作为食物来源的平板中，使其繁殖。对第二代子代个体可进行表型的目视筛选，例如运动功能缺陷等突变表型。
现在，让我们来介绍一种在线虫中进行反向遗传学筛选的实验方案。
在蠕虫中开展反向筛选的一种常用方法是，将线虫喂食一种含有表达双链RNA的细菌文库，每种细菌菌株表达一种特异的双链RNA，从而分别抑制线虫中一个候选基因的表达。这类文库通常可从商业途径获得，并可进一步扩增培养用于筛选实验。
实验开始时，分别培养含有单个文库克隆的细菌单菌落，并诱导其产生双链RNA。随后将菌液点样至含有线虫生长培养基的多孔板的不同孔中，并在无菌通风橱内干燥。
接下来，将线虫接种到各细菌点上，在湿润培养环境中培养三至四天。突变表型可快速显现，可能出现在最初接种到喂食板上的亲代线虫中，也可能出现在其子一代后代中。
现在您已经了解了正向遗传筛选和反向遗传筛选的实施方法，接下来我们讨论这些技术的一些当前应用。
某些遗传筛选可用于帮助科学家鉴定在物理上相互作用或在同一分子通路中发挥功能的蛋白质。在此项实验中，科学家设计了一种基于高通量显微镜的筛选方法，以发现能够激活特定信号分子的新型跨膜受体。通过在含有荧光标记信号蛋白的人胚胎肾细胞中过表达多种基因，研究人员能够监测哪些受体影响该蛋白的亚细胞定位。
遗传筛选的另一项应用是表征基因与药物之间的相互作用。在此例中，研究人员利用大规模随机诱变结合转座子插入，构建了一个突变酵母文库。随后，在含有药物的条件下培养每种突变菌株，并通过PCR结合微阵列或测序分析对各菌株的生长情况进行定量，从而确定与未突变对照相比对药物处理敏感的突变体。
最后，筛选技术还可用于理解在人类疾病中发生紊乱的基因及分子网络。本实验中，研究人员在神经元培养体系中引入编码RNA的病毒，以降低多种不同靶基因的表达水平。随后利用自动化分析对免疫染色细胞进行检测，揭示影响神经元物理特性的基因，例如神经突起的生长。该方法已成功鉴定了与神经退行性疾病相关的基因。
您刚刚观看了 JoVE 关于遗传筛选的视频——这是一种用于揭示参与重要生物学过程基因的强大技术。在本视频中，我们回顾了遗传筛选的主要类型、正向和反向筛选的一般实验流程，并探讨了这些方法在当今实验室中的应用。感谢您的观看！
基因筛选是鉴定导致特定表型的基因和突变的重要工具，也有助于理解基因在生物过程中的功能。基因筛选可在多种模式系统中进行，包括果蝇、线虫、植物和细胞培养，这些研究已帮助发现了新的细胞通路以及人类疾病的潜在药物靶点。
本视频将概述不同类型的基因筛选方法，介绍在线虫中进行基因筛选的两种通用实验方案，并展示当前实验室中基因筛选的一些应用实例。
首先，让我们了解一下什么是遗传筛选以及我们能从中获得哪些信息。
遗传筛选基于正向遗传学或反向遗传学。在正向或“经典”遗传筛选中，使用辐射或称为诱变剂的化学物质在生物体的DNA中随机产生突变。此外，还可以通过插入额外的碱基对来实现突变，例如利用被称为转座子的序列，这些序列可整合到基因组的不同位置，并破坏其插入基因的功能。这类插入通常与荧光报告基因偶联，以便直接检测突变生物体。当发现某个突变体表现出感兴趣的表型时，即可将该未知突变基因定位至染色体并进行测序。
与之相反的方法是反向遗传筛选，研究人员在此过程中干扰多个候选基因的表达，然后观察这些操作所导致的突变表型。
除了破坏基因活性的“功能缺失”突变外，遗传筛选也可基于“功能获得”突变，即导致基因表达水平或功能增强的突变。这可以通过将基因调控元件随机插入基因组中实现，这些元件会驱动其上游插入基因的过量表达。
另一种方法称为“表达筛选”，研究人员利用包含多种基因编码序列的质粒文库，将其导入细胞中，使这些基因在细胞内高水平表达。随后可通过分析产生的表型来理解基因功能。
为了进一步了解已知基因或突变的更多信息，可采用修饰因子筛选。抑制子筛选从一个特征明确的突变体出发，寻找能够使该突变体表型减轻的额外突变。若发现的抑制子突变位于与原始突变相同的基因内，则称为“基因内抑制”；若位于不同基因中，则称为“基因间抑制”。
相比之下，增强子筛选则用于鉴定加剧突变表型严重程度的额外突变。这类筛选有助于确定具有冗余性或可能存在功能相互作用的基因。当两个或多个突变组合导致生长严重受损甚至死亡时，这种情况被称为“合成致死或合成病态”。针对合成致死或合成病态突变的筛选可揭示在冗余但至关重要的生物学通路中发挥作用的基因。例如，在识别多个可同时作为药物靶点以杀死癌细胞的基因产物方面，这种方法尤为有用。
了解了一些常见的遗传筛选策略后，接下来我们来看一下在一种常用的模式生物——线虫中进行正向筛选的一般实验流程。
本示例中将使用甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate, EMS）进行化学诱变。EMS通过化学修饰鸟嘌呤核苷酸，使其在后续的DNA复制过程中错误地与胸腺嘧啶配对。由于EMS是一种诱变剂且可能具有致癌性，操作时必须佩戴双层手套，并在通风橱内进行。
首先，选取大量处于末期幼虫阶段的线虫，经洗涤后收集。将EMS加入线虫中，孵育数小时以诱导突变。诱变处理后，需去除线虫中的EMS，并用氢氧化钠将其灭活。随后，用培养基多次洗涤线虫，并将其接种至琼脂平板上。
接着，挑选外观健康的线虫转移至新制的、接种了细菌作为食物来源的平板中，使其繁殖。对第二代子代个体可进行表型的目视筛选，例如运动功能缺陷等突变表型。
现在，让我们来介绍一种在线虫中进行反向遗传学筛选的实验方案。
在蠕虫中开展反向筛选的一种常用方法是，将线虫喂食一种含有表达双链RNA的细菌文库，每种细菌菌株表达一种特异的双链RNA，从而分别抑制线虫中一个候选基因的表达。这类文库通常可从商业途径获得，并可进一步扩增培养用于筛选实验。
实验开始时，分别培养含有单个文库克隆的细菌单菌落，并诱导其产生双链RNA。随后将菌液点样至含有线虫生长培养基的多孔板的不同孔中，并在无菌通风橱内干燥。
接下来，将线虫接种到各细菌点上，在湿润培养环境中培养三至四天。突变表型可快速显现，可能出现在最初接种到喂食板上的亲代线虫中，也可能出现在其子一代后代中。
现在您已经了解了正向遗传筛选和反向遗传筛选的实施方法，接下来我们讨论这些技术的一些当前应用。
某些遗传筛选可用于帮助科学家鉴定在物理上相互作用或在同一分子通路中发挥功能的蛋白质。在此项实验中，科学家设计了一种基于高通量显微镜的筛选方法，以发现能够激活特定信号分子的新型跨膜受体。通过在含有荧光标记信号蛋白的人胚胎肾细胞中过表达多种基因，研究人员能够监测哪些受体影响该蛋白的亚细胞定位。
遗传筛选的另一项应用是表征基因与药物之间的相互作用。在此例中，研究人员利用大规模随机诱变结合转座子插入，构建了一个突变酵母文库。随后，在含有药物的条件下培养每种突变菌株，并通过PCR结合微阵列或测序分析对各菌株的生长情况进行定量，从而确定与未突变对照相比对药物处理敏感的突变体。
最后，筛选技术还可用于理解在人类疾病中发生紊乱的基因及分子网络。本实验中，研究人员在神经元培养体系中引入编码RNA的病毒，以降低多种不同靶基因的表达水平。随后利用自动化分析对免疫染色细胞进行检测，揭示影响神经元物理特性的基因，例如神经突起的生长。该方法已成功鉴定了与神经退行性疾病相关的基因。
您刚刚观看了 JoVE 关于遗传筛选的视频——这是一种用于揭示参与重要生物学过程基因的强大技术。在本视频中，我们回顾了遗传筛选的主要类型、正向和反向筛选的一般实验流程，并探讨了这些方法在当今实验室中的应用。感谢您的观看！
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Q1: What is the difference between forward and reverse genetic screens?
Forward genetic screens randomly generate mutations in an organism's DNA using mutagens or transposons, then identify unknown genes responsible for phenotypes of interest. Reverse genetic screens take the opposite approach: researchers target specific candidate genes for disruption, then observe resulting mutant phenotypes. Both methods help uncover gene function and biological pathways.
Q2: How do loss-of-function and gain-of-function mutations differ in genetic screens?
Loss-of-function mutations disrupt a gene's activity, reducing its expression or function. Gain-of-function mutations increase a gene's expression or functionality, often by inserting regulatory elements that drive overexpression. Expression screening uses plasmid libraries containing protein-coding sequences to achieve gain-of-function effects and understand gene function.
Q3: What are suppressor and enhancer screens used for?
Suppressor screens identify mutations that reduce the severity of an existing mutant phenotype, revealing genes that interact or compensate for the original mutation. Enhancer screens find mutations that increase phenotype severity, helping determine redundant or functionally interacting genes. Synthetic lethality screens reveal genes in essential but redundant pathways, useful for identifying drug targets in cancer therapy.
Q4: How is chemical mutagenesis performed in nematode worms?
In forward screens using nematodes, worms at the last larval stage are exposed to ethyl methanesulfonate (EMS), a chemical mutagen that modifies guanine nucleotides, causing mispairing with thymine during DNA replication. After several hours of incubation, EMS is removed and inactivated with sodium hydroxide. Worms are then washed, plated on agar with bacterial food, and allowed to reproduce for screening.
Q5: What is the protocol for reverse genetic screening in nematodes?
Reverse screens in nematodes use bacterial libraries expressing double-stranded RNA targeting individual candidate genes. Bacteria are cultured, spotted onto plates with nematode growth medium, and allowed to dry. Worms feed on the bacteria for three to four days in a humidified chamber, and mutant phenotypes are observed in original worms or first-generation progeny.
Q6: How are genetic screens applied to identify protein interactions and drug targets?
Researchers use high-throughput microscopy-based screens to discover receptors affecting signaling protein localization by overexpressing genes in cultured cells. For drug interactions, mutant libraries are grown with drugs, and growth is quantified using detection and quantification of nucleic acids by real time PCR followed by microarray or sequencing analysis to identify drug-sensitive strains.
Q7: How can genetic screens help understand genes involved in neurodegenerative diseases?
Researchers culture neurons in the presence of RNA-encoding viruses to knock down expression of many target genes. Automated analysis of immunostained cells reveals genes influencing neuronal properties like neurite outgrowth. This approach has successfully identified genes involved in neurodegenerative diseases, demonstrating how screens uncover molecular networks disrupted in human disease.