RNA-Seq

RNA测序（RNA-seq）是一种能够提供细胞群体中所有表达RNA的序列和数量信息的技术，这些RNA统称为“转录组”。与微阵列等其他表达谱分析方法不同，微阵列需要针对已知RNA序列进行探针杂交，而RNA-seq可用于基因组尚未测序的生物体进行基因表达谱分析。此外，与微阵列相比，RNA-seq能够更准确地测量更宽范围的转录本表达水平，尤其是在极低或极高表达水平时。

本视频将介绍RNA-seq的基本原理、RNA-seq文库构建及数据分析的实验方案，以及该技术的一些应用。

首先，让我们回顾一下 RNA-seq 背后的某些原理。转录组测序需要分离出待测定其表达水平的一群转录本。细胞中大多数 RNA 是核糖体 RNA（rRNA），即细胞蛋白质合成机器的核心组分。为了便于富集其他类型的转录本，通常在测序前通过将样本与连接在磁珠上的互补寡核苷酸杂交，并利用磁铁将 rRNA 从样本其余成分中分离，从而去除 rRNA。

alternatively，也可选择特定类别的 RNA 进行测序。例如，编码蛋白质的信使 RNA（mRNA）可通过“oligo-dT”进行捕获——即一段短的脱氧胸苷（deoxy-T）核苷酸序列，可结合这些转录本末端被称为 poly-A 尾的连续腺苷酸序列。随后去除污染性的 rRNA。microRNA 是一类长度为 22 个核苷酸的调控性 RNA，可根据其大小选择性地分离并用于测序。由于 RNA 本身易于降解，因此需首先将其逆转录为双链 DNA。

随后，将被称为接头（adaptors）的寡核苷酸序列连接到 DNA 片段两端。这些接头包含恒定区域，可作为后续 PCR 扩增的引物结合位点，通常设计为不对称结构，以保留模板链的方向性（“strandedness”）。接头中还包含称为“条形码”（barcodes）的独特序列，用于识别源自同一样本的所有片段。接着通过 PCR 对文库进行扩增。

使用含有与接头互补的寡核苷酸的测序芯片来固定文库样本，样本经稀释后使 DNA 分子以较低密度结合至芯片表面。DNA 在芯片上通过一种称为“桥式扩增”（bridge amplification）的过程进行扩增，形成“克隆簇”（clonal clusters）。随后从这些 DNA 模板的一端或两端合成长度为 30–150 个碱基的短片段，产生数亿条被称为测序读段（sequencing reads）的产物。

然后对测序结果进行质量分析并对数据进行处理。序列分析可揭示多种信息，包括不同样本间 RNA 表达水平的差异，以及此前未知的转录本或转录本异构体形式。

现在我们已经了解了RNA-seq的工作原理，接下来将逐步介绍RNA-seq文库的制备及序列数据分析的实验流程。首先从目标样本中提取RNA，并通过电泳检测其质量，例如使用一种称为生物分析仪（bioanalyzer）的微流控设备。为了获得准确的测序结果，RNA必须具有较高的质量。为确保无DNA污染，需对一个表达基因进行RT-PCR检测，分别在有和无逆转录酶的条件下进行反应；在无逆转录酶的情况下应无扩增产物。

为了富集带有poly-A尾的RNA，将样本与连接在磁珠上的寡核苷酸dT（oligo-dT）探针结合。所选RNA在镁离子存在下于高温条件下被片段化为约200个核苷酸长度的片段，以减少后续反应和分析中的长度依赖性偏差。随后将这些RNA片段反转录为双链DNA，并连接接头序列。通过PCR扩增文库，并利用生物分析仪和qPCR检测文库质量。生物分析仪的结果应显示一个峰，其大小与根据平均片段长度和接头长度预期的产物大小相符。

来自不同样本、含有不同条形码（barcoded）接头的文库可混合在一起，同时加入低浓度的参考DNA样本作为质量控制，用于监控后续步骤（如克隆簇生成和测序反应）的可靠性。将混合物加载至测序芯片并装入测序仪中。

在测序过程中需监测DNA簇的密度：密度过高可能导致交叉污染，密度过低则可能导致数据量不足。测序质量由Q值（Q score）表示，该值反映碱基识别错误的概率。大多数碱基的Q值应大于30，这意味着错误读取的概率低于千分之一。若参考DNA序列以预期比例被成功检出，则表明所有文库序列均被均匀代表。

测序产生的读段（reads）随后相互比对拼接，以推断原始被测序的RNA序列。对于已有基因组信息的生物体，可将读段比对至参考基因组。通过统计每条转录本所对应的读段数量，来衡量各RNA的表达丰度。

了解了RNA测序的工作原理后，让我们来看看它的一些应用方式。

转录组测序可用于鉴定在不同条件下差异表达的基因。例如，在本实验中，研究人员比较了在不同生长条件下产生的蚊子幼虫的转录组。尽管这种传播疾病的蚊子物种尚未完成基因组测序，研究人员仍能将获得的转录组信息与其他已测序物种进行比对，从而鉴定出表达水平升高或降低的基因。

RNA测序还可用于“大规模并行报告基因分析”（massively parallel reporter assays），以研究基因调控机制。该方法通过将包含数千种质粒的文库转染哺乳动物细胞来实现，每种质粒含有一个基因调控位点的突变变体，驱动与独特标签偶联的报告基因序列转录。在完成RNA提取和高通量测序后，通过评估每种标签的丰度来判断各个构建体中报告基因的表达水平，从而揭示各调控位点变体中突变核苷酸的功能重要性。

最后，RNA测序还可被改造用于研究RNA-蛋白质相互作用，特别是鉴定特定目标蛋白所结合的转录本。该方法利用抗体对目标蛋白进行免疫沉淀，并通过测序确定与其结合的RNA。如果在实验开始时对RNA-蛋白质复合物进行交联，则测序分析可精确定位交联位点，从而在核苷酸水平上识别RNA上蛋白质的结合位点。

您刚刚观看了 JoVE 关于 RNA-seq 的视频。在本视频中，我们展示了 RNA 样本如何被转化为文库、进行测序以及对所得数据进行分析，同时还介绍了测序分析所能提供的信息类型。得益于其高灵敏度、可在任何生物体中应用的潜力以及测序成本的降低，RNA-seq 正越来越多地被用于遗传学研究的多个领域，并将为细胞功能与发育相关的诸多问题提供深入见解。感谢观看！