染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation，简称“ChIP”）是一种研究人员用于评估蛋白质-DNA 相互作用的技术。蛋白质因子在基因调控中发挥着重要作用：它们不仅参与染色体中 DNA 的组织，还能够结合到特定的 DNA 序列（称为调控位点），从而激活或抑制基因表达。在 ChIP 实验中，染色质（由 DNA 及其相关蛋白质组成）通过抗体进行“免疫沉淀”，即利用抗体将目标复合物分离出来。借助该方法，研究人员可以确定哪些蛋白质与哪些 DNA 序列相结合。

在本视频中，我们将回顾染色质修饰及其在表观遗传调控中的作用，以及 ChIP 如何用于检测这些修饰。随后，我们将描述该技术的一般化操作流程，最后讨论当前科学家如何在研究中应用 ChIP 技术。

首先，让我们回顾一下什么是染色质修饰，以及如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术来研究这些修饰。

在真核生物中，DNA通过“缠绕”在蛋白质复合物上来储存在细胞核内。这些蛋白质是组蛋白，每一个被DNA缠绕的组蛋白复合物被称为“核小体”。基因表达受到“核小体占据”的调控，即一段DNA是否被包装进核小体中。转录活跃的DNA通常位于“无核小体”区域，这使得蛋白质能够结合到基因的调控位点，并允许RNA聚合酶进行转录。

目前的研究证据表明，调控基因表达的染色质结构变化是由组蛋白上的化学修饰介导的，这些修饰通常发生在组蛋白自由移动的“尾部”。最常见的修饰包括乙酰基、甲基和磷酸基团，它们被添加或去除于特定的氨基酸残基上。不同的组蛋白修饰与不同水平或模式的基因表达相关联。

例如，组蛋白H3亚基第27位赖氨酸残基上添加三个甲基基团（这一修饰称为H3K27me3）已被证实与基因沉默有关。相反，H3K9ac修饰，即在组蛋白H3第9位赖氨酸残基上添加一个乙酰基团，则与基因激活相关。

人们推测，组蛋白修饰通过标记染色质区域为“活跃”或“沉默”状态，在表观遗传调控基因表达中发挥重要作用。组蛋白修饰发挥作用的一种机制是招募转录因子或染色质“重塑”酶，后者能够物理性地移动核小体的位置。

利用ChIP技术，可以通过特异性抗体靶向特定的组蛋白修饰，并将这些修饰连同其周围的DNA一起“沉淀”下来。随后，研究人员可采用PCR、微阵列或测序技术来鉴定与特定组蛋白修饰相关的DNA区域。通过在ChIP实验中更换不同的抗体，该技术还可用于精确定位被转录因子及其他调控蛋白结合的DNA区域。

了解了染色质免疫沉淀（ChIP）技术的原理后，接下来我们来概述该技术的一般操作流程。

首先，收集目标细胞，并使用甲醛等化学试剂进行处理。这类试剂作为“交联”剂，通过促进蛋白质与其结合的DNA序列之间形成共价键，从而将蛋白质固定在DNA上。需注意避免对细胞进行“过度”甲醛处理，因为这可能会影响后续ChIP步骤中抗体识别其靶向组蛋白修饰的能力。为终止交联反应，向处理细胞的甲醛溶液中加入甘氨酸。随后收集细胞并裂解，以释放染色质。

为了溶解染色质并精确界定与修饰组蛋白结合的DNA区域，需利用声波将染色质机械性地“剪切”成较小片段，该过程称为超声处理（sonication）。通常，科研人员希望获得长度为200至1000个碱基对的染色质片段。当生成合适大小的染色质片段后，向溶液中加入特异性抗体，并孵育混合物，使抗体有足够时间识别其靶向的组蛋白修饰。

随后将可与抗体结合的磁珠加入混合体系，从而使与抗体结合的染色质复合物被固定。利用磁力架收集磁珠，并多次洗涤以去除未结合的染色质或抗体。

为了从磁珠上释放染色质，将磁珠置于含有去垢剂SDS的溶液中处理；用磁铁收集磁珠后，保留上清液。然后向上清液中加入蛋白酶K，以降解包括组蛋白在内的所有蛋白质，从而分离出染色质中的DNA组分。最终获得的DNA经过纯化后进行分析。

现在让我们来看看科学家们目前如何在实验室中使用染色质免疫沉淀（ChIP）技术。

许多研究人员利用ChIP来评估由细胞外信号引起的组蛋白修饰变化。在此实验中，培养的人类细胞经特定细胞因子（即信号分子）处理后，研究人员检测了组蛋白甲基化的变化。通过实时PCR对ChIP富集的DNA进行分析，研究者发现，在处理刺激下，编码转录因子的基因IRF1获得了激活型组蛋白标记H3K36me3。该修饰使得一种调控蛋白和RNA聚合酶II均能结合到IRF1上，从而启动其转录。

ChIP还可用于深入了解组织损伤与再生过程中发生的基因表达变化。在该实验中，研究人员损伤了小鼠周围神经系统的一个组成部分——坐骨神经，随后利用ChIP在其他周围神经系统结构（如脊髓两侧的神经节）中寻找新的DNA-蛋白质相互作用。科学家得出结论：神经损伤后，作为DNA修复调控因子的p53蛋白会与一个参与组织再生的基因GAP43结合。

最后，一些科学家正致力于优化ChIP实验流程，以提高实验的通量和效率。在此项研究中，研究人员实现了ChIP的“自动化”，由机器完成实验方案中的多个步骤。这使得研究人员能够使用相对较少的细胞（约10,000个）同时检测与多种不同组蛋白修饰相关的DNA，所得结果与使用较多细胞数量或传统“手动”ChIP技术获得的结果相似。

您刚刚观看了 JoVE 关于染色质免疫沉淀的视频。在本视频中，我们讨论了 DNA 与蛋白质如何共同形成染色质，以及一种名为 ChIP 的实验方案的各个步骤，该方案可用于鉴定与特定染色质状态或蛋白质相关的 DNA 序列。我们还探讨了研究人员如何应用并改进 ChIP 技术，以更深入地理解 DNA-蛋白质相互作用在基因调控中的作用。一如既往，感谢您的观看！