重组工程与基因靶向
现代生物学中最广泛使用的工具之一是利用限制性内切酶进行分子克隆，该技术可在DNA片段之间产生兼容的末端，使其能够连接在一起。然而，这一技术存在某些局限性，限制了其在构建大型或复杂DNA结构中的应用。一种较新的技术——重组工程（recombineering），通过同源重组（HR）来修饰DNA，即基于序…
通过同源重组进行克隆，即重组工程（recombineering），极大地提升了研究人员进行高通量基因工程操作的能力。传统的分子克隆需要使用相同的限制性内切酶对载体和插入片段进行消化，以产生可兼容的末端用于“重组”；然而，特别是在试图从较长序列（如一段基因组DNA）中分离特定区域时，往往难以找到仅在目标区域周围特异性切割、而不在该区域内或序列其他位置切割的限制性酶。由于无需依赖这些限制性位点，重组工程为构建基因工程载体提供了一种更为高效且经济的方法。
在本视频中，我们将介绍基因重组的基本原理，提供一个用于重组工程构建基因靶向载体的通用实验方案，并讨论这些技术的若干应用。
首先，让我们讨论一下什么是重组以及如何应用它。
基因重组是指 DNA 分子之间交换遗传信息的过程。在“同源重组”中，相对较大片段的相似或相同 DNA 序列被交换。细胞利用这一过程来修复双链断裂，而进行有性生殖的真核生物在减数分裂期间也会在同源染色体之间进行同源重组，以增加遗传多样性。
同源重组已被广泛应用于多种实验目的，包括对细胞中特定内源位点进行修饰——这一过程称为“基因靶向”。它还被用于遗传构建体的构建，即所谓的“重组工程”（recombineering），这对于对大片段 DNA 进行修饰并靶向整合到生物体基因组中尤为有用。为此，研究人员可以利用“基因组文库”，即包含长片段基因组 DNA 的一系列载体。目前已构建出多种不同容量的文库，通常在细菌克隆中扩增，可从商业或非营利性机构订购。其中最常用的基因组文库类型之一是细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC），其可携带 150–350 千碱基对的插入片段。
为了进行重组工程操作，科学家需要一种能够发生同源重组的生物体。酵母 Saccharomyces cerevisiae 天然具有“重组能力”，能够高效地在载体与插入片段之间进行同源重组。另一种常用系统来源于λ噬菌体的“Red”蛋白，该系统可在细菌 E. coli 中重建。研究人员可以在已建立的表达 Red 蛋白的细菌菌株中进行重组工程操作，也可以将编码 Red 系统组分的质粒与重组工程底物共同转化至细菌中。
现在，让我们逐步介绍通过重组工程构建基因靶向载体的实验方案。
本实验方案的目的是创建一种具有特定基因靶向修饰的基因工程小鼠。简而言之，目标基因的所需修饰首先在BAC（细菌人工染色体）中完成；随后将修饰后的序列“回收”至靶向载体中，再将该载体转染至胚胎干细胞以实现基因靶向。这些干细胞可用于生成基因修饰动物。有关该最终步骤的详细操作，请参阅JoVE科学教育视频《模式生物的基因工程》。
首先，筛选并获取包含目标基因组序列的BAC克隆。接着，设计同源臂，即含有30–50个碱基对同源区域的寡核苷酸。这些寡核苷酸在PCR反应中作为引物，用于扩增用于修饰目标基因的DNA“片段”。这些片段通常包含例如抗生素抗性基因等可作为筛选标记的元件，可通过多种公开可得的质粒轻松扩增。随后，通过电穿孔等方法将编码Red重组系统组分的质粒转化至BAC细菌克隆中，接着再导入含有同源臂的DNA片段。然后将细菌在适当温度下培养，以诱导同源重组发生。
为了从BAC中回收修饰后的序列，需使用含有同源臂的引物对“回收”载体进行线性化和扩增，这些同源臂覆盖修饰位点周围数个千碱基的区域。将该线性化载体骨架转化至BAC细菌克隆中，并再次诱导重组工程。载体将通过从BAC中“回收”相应的序列实现“缺口修复”。最终获得的基因靶向载体不仅包含目标修饰序列，还含有与修饰序列周边基因组DNA同源的区域。该载体可被纯化、线性化后导入胚胎干细胞，在细胞内源性同源重组机制的作用下，将修饰序列靶向整合至基因组对应位点，从而实现对宿主基因组的改造。
现在让我们来看一些基于重组的基因工程技术的应用。
首先，研究人员可以利用重组工程快速、简便地改造细菌基因组，例如用于研究蛋白质复合物。在此例中，设计了一个编码串联肽亲和标签以及卡那霉素抗性筛选标记的表达盒，将其通过重组工程插入目标基因的3¢端。随后将该载体导入具有“重组能力”的Red系统大肠杆菌（E. coli）中，并通过选择性培养基分离出成功的重组子。利用能与标签高亲和力结合的蛋白，对带标签的蛋白质复合物进行生物化学纯化，再通过质谱分析鉴定目标蛋白的相互作用伙伴。
重组工程与基因靶向技术也可用于修饰寄生生物的基因组，例如引起弓形虫病的专性胞内寄生虫Toxoplasma gondii。在该研究中，靶向载体在酵母中通过重组工程构建，其中目标基因两侧的基因组序列被置于筛选标记的两侧。随后将载体线性化并通过电穿孔导入寄生虫中。在选择性培养基上进行有限稀释平板培养，以分离成功重组的克隆；在这些克隆中，寄生虫自身的同源重组机制将基因组序列替换为工程化序列，从而实现目标基因的敲除。通过PCR扩增靶向区域，确认阳性重组事件。
最后，研究人员开发出一种称为“亚克隆加插入”（subcloning plus insertion, SPI）的方法，可在同一过程中同时实现缺口修复和表达盒插入，使重组工程操作更简便、更灵活。该方法成功的关键在于多个同源臂的合理设计：其长度可达180 bp，比传统重组工程更长，以提高重组效率。通过PCR将同源臂引入亚克隆质粒和插入表达盒后，将二者共同转化至表达Red蛋白的BAC克隆中并诱导重组工程。随后通过PCR或限制性酶切分析鉴定成功完成重组的构建体。
您刚刚观看了JoVE关于重组工程的视频。在本视频中，我们讨论了重组技术的原理及其在基因工程中的应用、一个重组工程项目的操作流程，以及这些技术的若干应用实例。一如既往，感谢您的观看！
通过同源重组进行克隆，即重组工程（recombineering），极大地提升了研究人员进行高通量基因工程操作的能力。传统的分子克隆需要使用相同的限制性内切酶对载体和插入片段进行消化，以产生可兼容的末端用于“重组”；然而，特别是在试图从较长序列（如一段基因组DNA）中分离特定区域时，往往难以找到仅在目标区域周围特异性切割、而不在该区域内或序列其他位置切割的限制性酶。由于无需依赖这些限制性位点，重组工程为构建基因工程载体提供了一种更为高效且经济的方法。
在本视频中，我们将介绍基因重组的基本原理，提供一个用于重组工程构建基因靶向载体的通用实验方案，并讨论这些技术的若干应用。
首先，让我们讨论一下什么是重组以及如何应用它。
基因重组是指 DNA 分子之间交换遗传信息的过程。在“同源重组”中，相对较大片段的相似或相同 DNA 序列被交换。细胞利用这一过程来修复双链断裂，而进行有性生殖的真核生物在减数分裂期间也会在同源染色体之间进行同源重组，以增加遗传多样性。
同源重组已被广泛应用于多种实验目的，包括对细胞中特定内源位点进行修饰——这一过程称为“基因靶向”。它还被用于遗传构建体的构建，即所谓的“重组工程”（recombineering），这对于对大片段 DNA 进行修饰并靶向整合到生物体基因组中尤为有用。为此，研究人员可以利用“基因组文库”，即包含长片段基因组 DNA 的一系列载体。目前已构建出多种不同容量的文库，通常在细菌克隆中扩增，可从商业或非营利性机构订购。其中最常用的基因组文库类型之一是细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC），其可携带 150–350 千碱基对的插入片段。
为了进行重组工程操作，科学家需要一种能够发生同源重组的生物体。酵母 Saccharomyces cerevisiae 天然具有“重组能力”，能够高效地在载体与插入片段之间进行同源重组。另一种常用系统来源于λ噬菌体的“Red”蛋白，该系统可在细菌 E. coli 中重建。研究人员可以在已建立的表达 Red 蛋白的细菌菌株中进行重组工程操作，也可以将编码 Red 系统组分的质粒与重组工程底物共同转化至细菌中。
现在，让我们逐步介绍通过重组工程构建基因靶向载体的实验方案。
本实验方案的目的是创建一种具有特定基因靶向修饰的基因工程小鼠。简而言之，目标基因的所需修饰首先在BAC（细菌人工染色体）中完成；随后将修饰后的序列“回收”至靶向载体中，再将该载体转染至胚胎干细胞以实现基因靶向。这些干细胞可用于生成基因修饰动物。有关该最终步骤的详细操作，请参阅JoVE科学教育视频《模式生物的基因工程》。
首先，筛选并获取包含目标基因组序列的BAC克隆。接着，设计同源臂，即含有30–50个碱基对同源区域的寡核苷酸。这些寡核苷酸在PCR反应中作为引物，用于扩增用于修饰目标基因的DNA“片段”。这些片段通常包含例如抗生素抗性基因等可作为筛选标记的元件，可通过多种公开可得的质粒轻松扩增。随后，通过电穿孔等方法将编码Red重组系统组分的质粒转化至BAC细菌克隆中，接着再导入含有同源臂的DNA片段。然后将细菌在适当温度下培养，以诱导同源重组发生。
为了从BAC中回收修饰后的序列，需使用含有同源臂的引物对“回收”载体进行线性化和扩增，这些同源臂覆盖修饰位点周围数个千碱基的区域。将该线性化载体骨架转化至BAC细菌克隆中，并再次诱导重组工程。载体将通过从BAC中“回收”相应的序列实现“缺口修复”。最终获得的基因靶向载体不仅包含目标修饰序列，还含有与修饰序列周边基因组DNA同源的区域。该载体可被纯化、线性化后导入胚胎干细胞，在细胞内源性同源重组机制的作用下，将修饰序列靶向整合至基因组对应位点，从而实现对宿主基因组的改造。
现在让我们来看一些基于重组的基因工程技术的应用。
首先，研究人员可以利用重组工程快速、简便地改造细菌基因组，例如用于研究蛋白质复合物。在此例中，设计了一个编码串联肽亲和标签以及卡那霉素抗性筛选标记的表达盒，将其通过重组工程插入目标基因的3¢端。随后将该载体导入具有“重组能力”的Red系统大肠杆菌（E. coli）中，并通过选择性培养基分离出成功的重组子。利用能与标签高亲和力结合的蛋白，对带标签的蛋白质复合物进行生物化学纯化，再通过质谱分析鉴定目标蛋白的相互作用伙伴。
重组工程与基因靶向技术也可用于修饰寄生生物的基因组，例如引起弓形虫病的专性胞内寄生虫Toxoplasma gondii。在该研究中，靶向载体在酵母中通过重组工程构建，其中目标基因两侧的基因组序列被置于筛选标记的两侧。随后将载体线性化并通过电穿孔导入寄生虫中。在选择性培养基上进行有限稀释平板培养，以分离成功重组的克隆；在这些克隆中，寄生虫自身的同源重组机制将基因组序列替换为工程化序列，从而实现目标基因的敲除。通过PCR扩增靶向区域，确认阳性重组事件。
最后，研究人员开发出一种称为“亚克隆加插入”（subcloning plus insertion, SPI）的方法，可在同一过程中同时实现缺口修复和表达盒插入，使重组工程操作更简便、更灵活。该方法成功的关键在于多个同源臂的合理设计：其长度可达180 bp，比传统重组工程更长，以提高重组效率。通过PCR将同源臂引入亚克隆质粒和插入表达盒后，将二者共同转化至表达Red蛋白的BAC克隆中并诱导重组工程。随后通过PCR或限制性酶切分析鉴定成功完成重组的构建体。
您刚刚观看了JoVE关于重组工程的视频。在本视频中，我们讨论了重组技术的原理及其在基因工程中的应用、一个重组工程项目的操作流程，以及这些技术的若干应用实例。一如既往，感谢您的观看！
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Q1: What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?
Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.
Q2: What are the key components needed to perform a recombineering experiment?
Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.
Q3: How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?
Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.
Q4: What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?
A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.
Q5: How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?
Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.
Q6: What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?
Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.
Q7: Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?
In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.