Question 1

什么是同源重组以及它与经典分子克隆有何不同？

Accepted Answer

同源重组是基于相似或相同序列片段之间的DNA交换。与传统的分子克隆不同，后者需要特定的限制酶位点来生成兼容的末端，同源重组避免了这一限制。这使得重组成为一种更高效和成本效益更高的方法，特别是当目标区域周围没有限制位点时。

Question 2

进行重组实验需要哪些关键组件？

Accepted Answer

重组需要具有重组能力的生物体，例如酵母菌酿酒酵母或大肠杆菌表达来自噬菌体lambda的Red蛋白。研究人员还需要含有长DNA片段的基因组文库，常用的是细菌人工染色体（BAC），因为它们携带的插入片段大小在150-350千碱基对之间。这些组件能够在载体和插入片段之间实现高效的同源重组。

Question 3

在重组工程协议中，同源臂是如何设计和使用的？

Accepted Answer

同源臂是含有30-50个碱基对同源区域的寡核苷酸，设计用于flank目标序列。这些在PCR反应中作为引物，以生成修饰目标基因的DNA盒。在像亚克隆加插（SPI）这样的高级程序中，同源臂可以长达180 bp以增加重组效率，使过程更灵活和可靠。

Question 4

在创建基因靶向构建体中，检索矢量的目的是什么？

Accepted Answer

检索载体使用包含修改位点周围数千碱基对同源臂的引物进行线性化和扩增。当转化为BAC克隆时，载体通过从BAC中检索修改后的序列而进行间隙修复。这产生了一个基因靶向载体，其中包含修改后的序列以及与基因组DNA同源的区域，然后可以将其引入胚胎干细胞中以进行靶向基因组修饰。

Question 5

如何将重组技术应用于研究细菌中的蛋白质相互作用？

Accepted Answer

研究人员设计了编码顺序肽亲和标签和选择标记（如卡那霉素抗性）的穿梭质粒，然后将它们重组到Red能效大肠杆菌中目标基因的3'末端。使用选择培养基分离出成功的重组体。然后使用与标签结合的蛋白质对标记的蛋白质复合物进行生化纯化，并通过质谱分析来鉴定相互作用伙伴。

Question 6

重组工程在修改寄生虫基因组方面有哪些优势？

Accepted Answer

重组工程使得在弓形虫等寄生生物中能够精确修改基因组。在酵母中，用目标基因两侧的基因组序列构建的靶向载体被进行重组，然后在寄生生物中进行线性化和电穿孔。寄生生物的同源重组机制将基因组序列替换为工程化版本，有效地删除或修改目标基因。PCR 确认成功的重组事件。

Question 7

为什么适当的同源臂设计对亚克隆加插入（SPI）的成功至关重要？

Accepted Answer

在SPI中，间隙修复和卡式带插入同时发生，需要精确的同源臂设计以确保高效重组。与传统重组技术相比，SPI中的同源臂更长，可达180 bp，从而提高了重组效率和成功率。在PCR扩增并整合到亚克隆质粒和插入卡式带后，它们被转化到表达Red酶的BAC克隆中，并通过核酸检测和定量或限制性内切酶消化分析进行验证。

重组工程与基因靶向 - 评估测验