基因组编辑

基因组编辑是一类使研究人员能够“编辑”或改变特定DNA序列的技术。这些方法依赖于在DNA中产生微小的“切割”，细胞会尝试修复这些切割，但往往修复不完全。通过这种方式，科学家可以比传统的基因靶向方法更高效地在目标序列中诱导突变。

在本视频中，我们将回顾三种基因组编辑技术背后的原理，并讨论其中一种技术——CRISPR-Cas9系统——的通用实验方案。随后，我们将探讨这些方法的一些应用。

首先，让我们了解一下基因组编辑背后的原理。

在基因组中对特定序列引入遗传改变的经典方法是通过同源重组进行基因靶向，其中将同源序列整合到靶向载体中，从而用修饰版本“替换”内源基因。

与基因靶向类似，基因组编辑也可将改变靶向特定DNA区域，但其效率显著更高，能够在单次实验中使更多细胞产生预期的突变。

所有基因组编辑方法都依赖于细胞修复核酸内切酶在DNA上造成的双链断裂的能力。这种损伤可通过非同源末端连接（NHEJ）修复，即直接重新连接断裂的DNA末端；或通过同源定向修复（HDR）修复，即以同源序列为模板复制修复损伤。NHEJ通常并不精确，可能导致修复后的DNA中缺失或插入数个碱基，从而引起靶序列突变。另一方面，HDR允许研究人员引入模板，以指导在靶位点进行特定的改变。

近年来，已有三种主要的基因组编辑技术被开发并广泛应用。

其中一种方法中，研究人员将某些转录因子的DNA结合“锌指”结构域与核酸内切酶FokI的DNA切割结构域融合。由于每个锌指结构域可识别特定的三联核苷酸，这些结构域可被人工串联组合，从而构建出可靶向特定DNA序列的锌指核酸酶（ZFNs）。

类似地，另一类称为“TALENs”的核酸酶将FokI与一类名为转录激活子样效应因子（TALEs）的细菌蛋白的可变DNA结合结构域融合。每个TALE结构域识别一个特定的DNA碱基，从而赋予TALENs序列特异性。

最后，CRISPR-Cas9系统利用了一种原核生物免疫系统的组分，该系统通常用于保护宿主免受病毒或质粒等外源遗传物质的侵入。在此系统中，入侵的外源DNA片段（称为“前间隔序列”）被整合到CRISPR位点中，随后被蛋白-RNA复合物转录并加工成称为crRNA的小RNA分子。

科学家通过设计类似crRNA的“单链向导”RNA（sgRNA），利用CRISPR系统实现基因组编辑，该sgRNA可用于将Cas9靶向哺乳动物细胞或其他感兴趣系统中几乎任意指定的遗传序列。基于RNA序列的CRISPR-Cas9系统具有高度可定制性，相较于ZFNs和TALENs等基于蛋白质的基因组编辑方法具有明显优势。

现在您已经了解了基因组编辑的基本原理，接下来让我们回顾一下使用 CRISPR 在哺乳动物细胞中实现靶向遗传修饰的典型实验流程。

首先，选择需要编辑的基因组位点。该区域必须较短，大约为 20 个碱基对，并在其 3′ 端含有一段由 3 个碱基组成的“前间隔序列邻近基序”（protospacer adjacent motif，简称 PAM）。PAM 是 Cas9 识别并切割目标 DNA 区域所必需的，其确切序列取决于所用 Cas9 的来源生物。一旦确定了潜在的靶位点，应将其序列与整个基因组进行比对，以确保该序列在基因组其他位置无相似序列，从而避免脱靶效应的发生。

为了合成 CRISPR 引导序列，需设计两条寡核苷酸链，其中一条与目标序列相同，另一条则为其互补链。在它们的 5′ 端还需添加额外序列，以确保与 sgRNA 载体兼容。将这两条寡核苷酸混合后进行变性处理，再退火形成双链结构。

接下来，使用适当的限制性内切酶切割含有 sgRNA “骨架”序列的质粒，然后将其与合成的 CRISPR 引导序列混合，并加入连接酶进行孵育，从而构建出完整的 sgRNA 载体。该质粒可被转化至细菌中进行扩增培养。从细菌中纯化得到 CRISPR 构建体后，将其与编码 Cas9 的质粒共同转染至目标细胞中，以实现对其基因组的编辑。转染后的细胞继续培养，形成单克隆细胞集落。

可从每个克隆中提取基因组 DNA，并通过 PCR 或测序分析，筛选出 CRISPR 系统已成功引入预期突变的细胞克隆。

现在让我们来看一些科学家正在使用基因组编辑技术的方法。

许多研究人员利用基因组编辑将报告基因序列插入特定的基因位点。在此实验中，研究人员使用锌指核酸酶（ZFNs）将绿色荧光蛋白（GFP）插入一个参与神经元发育和存活的基因中。为验证该基因是否被准确靶向，研究人员诱导干细胞分化为神经元，并对GFP和神经元标志物进行双重免疫荧光染色分析。

基因组编辑还使得构建“基因敲除”生物体变得更加简便，即让目标基因失去功能。在此项研究中，研究人员通过向胚胎中注射编码靶向特定基因的转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）的mRNA，以制备基因敲除小鼠。随后对经TALEN处理的小鼠DNA进行内切酶消化，研究人员得以鉴定出目标基因两个拷贝均发生突变的个体。

最后，基因组编辑还可通过在同一染色体区域造成两个双链断裂，实现大片段的基因删除。当常规基因组编辑方法所造成的小片段缺失不足以使某个基因或遗传元件失活时，此类大片段删除可能是必要的。在此实验中，研究人员将小鼠癌细胞与一个GFP载体以及两个分别靶向癌基因内部不同区域的CRISPR载体共电穿孔。成功转染的细胞会表达GFP荧光信号，可通过荧光激活细胞分选技术进行分离；后续通过PCR和测序分析，确认了两个CRISPR靶位点之间的DNA区域被成功删除的细胞。

您刚刚观看了 JoVE 关于基因组编辑的视频。在本视频中，我们回顾了 ZFNs、TALENs 和 CRISPR 技术背后的原理，探讨了一般的 CRISPR-Cas9 实验方案，并讨论了研究人员当前如何应用基因组编辑技术。一如既往，感谢您的观看！