活细胞有丝分裂成像

有丝分裂是细胞周期中细胞核内容物高度有序且受控的分裂过程。有丝分裂对生物体的正常发育以及组织的生长、维持和修复至关重要。该过程的紊乱已被证实与某些疾病（如癌症）相关。目前，实验室研究有丝分裂最常用的方法之一是通过时间序列荧光显微镜进行活细胞成像。

本视频将简要介绍有丝分裂的各个阶段，然后讨论对该细胞过程进行活细胞成像时的实验设计要点。我们将展示详细的数据采集与分析流程，并最后介绍该技术的一些应用实例。

为了更好地理解科学家在这些成像实验中所关注的内容，我们首先来回顾一下有丝分裂的各个阶段。

细胞周期描述了细胞生长和分裂的整体过程。其中，有丝分裂期仅占该周期的一个较短阶段，可进一步分为六个时期：即前期、前中期、中期、后期、末期和胞质分裂。

在前期，DNA凝聚形成由着丝粒连接的姐妹染色单体。在细胞质中，两个被称为中心体的关键细胞器开始以轮状模式组装微管结构，通常称为纺锤丝。

下一个阶段是前中期，此时核膜发生解体，并在着丝粒处组装一种称为动粒的蛋白质复合物。此阶段还发生纺锤丝与动粒的连接。

在中期，染色体排列在赤道板上，这是一个距离两个中心体等距的假想平面。在后期，染色体在着丝粒处“分离”，单个姐妹染色单体向细胞的两极移动。在末期，有丝分裂纺锤体解体，染色质开始去凝集。最后，在胞质分裂过程中，通过肌动蛋白/肌球蛋白环的收缩形成“分裂沟”，母细胞分裂为两个子细胞。

在了解有丝分裂进程的基础上，让我们来看看利用活细胞成像技术观察这一过程时需要考虑的实践问题。

首先要考虑的问题是：如何对细胞进行标记以实现有丝分裂的可视化？该实验中最常用的“标记物”是荧光分子，这类分子可吸收特定波长的光，并发射出另一波长的光。

为了标记核酸，可以使用能够穿透细胞膜的DNA结合染料，例如 Hoechst。若要标记微管等蛋白质，则可使用带有荧光标记的抗体。这类抗体通常无法穿透细胞膜，因此需要采用显微注射技术将其导入样品中。

另一种策略是遗传标记，即通过改造细胞使其表达带有荧光标记的蛋白质，从而标记主动参与有丝分裂的组分，例如染色体。在使用荧光分子时，必须避免过度暴露于光照，以防发生光漂白。

选择合适的显微镜同样至关重要。最常用的两种显微镜是落射荧光显微镜和共聚焦显微镜。落射荧光显微镜（又称宽场显微镜）将光线照射至整个视野，而共聚焦显微镜则利用激光将光线聚焦于单个点上。

尽管落射荧光显微镜通常成本较低，但共聚焦显微镜更受青睐，因为点照明可提高光学分辨率，从而获得更清晰的图像。同时，单点照明还能降低光毒性，即因光照过度导致的细胞死亡增加。

在回顾了一些实验注意事项之后，让我们来看看如何进行活细胞成像实验以观察有丝分裂过程。

细胞应培养在玻璃底培养皿或盖玻片上，以便最佳地观察有丝分裂。随后，在标记操作完成前，应将细胞维持在受控环境中。如前所述，标记方法的选择取决于具体的实验需求。完成标记后，将细胞培养皿放入显微镜的专用培养腔室中，以在成像过程中维持细胞培养条件。

接下来，根据所使用的标记分子，设置显微镜的激发和发射波长。进行数据采集时，需设定图像采集的时间点和位置。此处的时间点是指获取图像的具体时刻，以完整覆盖所有有丝分裂阶段的动态过程；位置则指培养皿上的X-Y坐标。此外，针对每个位置，还可以在不同焦深下采集图像，每幅图像代表Z轴上的一个光学切片，这些图像合称为Z轴层扫（Z-stacks）。输入所有参数后，先测试设置是否正确，然后即可静待实验结果！

获取延时数据后，有多种方式可以呈现这些数据。下面我们讨论其中几种方法。

图像拼接（montage）是呈现延时数据最常用的方法之一，它将多个图像按时间顺序排列成网格状。这种方法能够清晰展示有丝分裂的进程，并使研究人员能够确定诸如各分裂阶段所持续时间等信息。将这些图像按顺序组合生成“视频”，则可实现更为动态的展示。

最后，利用共聚焦显微镜获得的Z轴层扫图像（Z-stacks）可被合并，以重建样本的三维结构。这种方法能够准确揭示有丝分裂装置各组分之间的空间关系。这一点非常重要，因为在二维图像中看似相邻的结构，在三维空间中实际上可能相距较远。

现在您已经了解了如何进行活细胞成像实验，接下来让我们回顾一下该技术的一些应用。

有丝分裂是发育过程中的关键环节。在此研究中，科研人员分离了小鼠胚胎脑组织，以观察神经前体细胞中的有丝分裂过程。这些细胞的有序分裂对于大脑的正常发育和功能至关重要。分离后，脑组织使用振动切片机进行切片，用膜通透性的核酸结合染料染色，并通过共聚焦显微镜成像，从而清晰地观察神经前体细胞的有丝分裂过程。

DNA修复是一种重要的细胞过程，参与细胞的生长与分裂。在本实验中，研究人员研究了一种DNA修复蛋白，该蛋白会在DNA损伤后形成焦点（foci），即呈现为点状结构。活细胞成像结合三维分析的结果揭示了该DNA修复蛋白在整个细胞分裂过程中的定位变化。

最后，研究人员还研究了有丝分裂检查点，即细胞在继续分裂前评估自身状态的“暂停”节点。在有丝分裂中，纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint, SAC）可确保有丝分裂纺锤体与染色体之间的正确连接。为研究这一机制，科学家将可诱导SAC的试剂显微注射到转基因果蝇胚胎中，并利用活细胞成像分析有丝分裂过程。结果显示动粒发生停滞，表明这些细胞无法顺利完成有丝分裂进程。

您刚刚观看了 JoVE 关于有丝分裂活细胞成像的视频。在简要介绍有丝分裂的各个阶段后，本视频讲解了活细胞成像中的关键注意事项及数据分析技术。最后，展示了该技术的应用。活细胞成像极大地帮助科学家深入理解与发育、组织维持及疾病相关的有丝分裂机制。一如既往，感谢您的观看！