Transwell 迁移实验

Transwell 迁移实验是一种经典技术，可使科研人员定量分析细胞运动。迁移是指细胞以单个或成簇方式移动的能力。细胞运动依赖于细胞骨架的精确重构，通常在受到作为信号刺激的诱导下发生。

今天我们将讨论 Transwell 迁移实验，该实验利用简单的腔室装置来评估细胞在趋化信号诱导下的迁移能力。

首先，我们将介绍一些关于Transwell小室的背景信息。

该装置最初由Stephen Boyden博士于1961年设计，用于研究白细胞迁移，因此该方法也被称为Boyden小室实验。

在简单的Boyden小室中，外壁为孔板的孔壁结构，类似于96孔板中的孔。每个孔内放置一个Transwell，即一种圆柱形的插入式小室。该插入小室带有孔径明确的聚碳酸酯膜，当其置于孔中时，会将腔室分为两个区域：上层区域用于接种待研究迁移行为的细胞，下层储液区则用于加入趋化因子溶液。根据定义，趋化因子是一类能够通过“吸引细胞”来促进细胞运动的分子。

由于这些趋化作用，上层区域的细胞会穿过膜上的孔迁移至下层储液区。如果细胞具有黏附特性（如某些黑色素瘤细胞），在迁移后会“黏附”在膜的底面。此时，可对膜进行固定、染色，并在显微镜下计数细胞。相反，对于非黏附性细胞（如精子），它们会迁移进入下层储液区，此时可通过血细胞计数板对储液区中的细胞进行计数。

尽管该实验的设置较为简单，但在实验前仍有一些事项需要考虑。让我们回顾其中的几点。

首先是接种溶液，必须确保细胞密度经过优化，以便观察细胞迁移。细胞密度过低可能导致迁移无法检测，而密度过高则会使膜上细胞过度生长，难以准确计数迁移细胞。第二个需要考虑的因素是插入式培养小室的孔径大小，应根据细胞类型谨慎选择。如果孔径过小，细胞将无法穿过；

反之，若孔径过大，细胞会直接掉落穿过膜，这并不属于迁移行为。最后，还需注意趋化因子的浓度以及允许细胞迁移的孵育时间，因为这两者相互关联。在孵育期间，若能维持上下室之间的浓度梯度，并采用适当的趋化因子浓度，可有效诱导细胞因趋化作用而发生迁移。相反，过长的孵育时间可能导致趋化因子在 chamber 内部达到平衡，从而消除化学梯度，干扰实验结果的分析。

考虑到这些因素，让我们讨论一种用于测量贴壁细胞迁移的实验方案。

待检测的细胞应使用不含蛋白酶的培养基进行制备，因为蛋白酶可能使重要的膜受体变性，从而最终影响细胞迁移。细胞制备完成后，应将细胞悬液稀释至最佳接种密度。为准备实验装置，需将Transwell小室放入多孔板的孔中。将细胞悬液用移液器加入Transwell小室内时，应避免接触膜表面或引入气泡。

将趋化因子溶液加入下室，确保溶液与插入膜的底部接触。迁移孵育时间需根据具体实验条件确定。孵育结束后，通过将插入膜浸入70%乙醇中进行固定。待插入膜干燥后，加入细胞染色液。

接着，将细胞在室温下孵育约30分钟。孵育结束后，使用洗涤缓冲液清洗插入膜。最后，可将膜切下并置于显微镜载玻片上。位于膜下表面的细胞数量反映了在有或无趋化因子存在条件下发生迁移的细胞数量。

现在您已经对实验方案有了初步了解，接下来让我们简要看看研究人员如何在探索中应用这一方法。

该检测最常见的应用之一是评估未知化合物的趋化特性。在此实验中，科学家希望研究蛙类精子在存在由两栖动物卵分泌的物质——allurin 时的游动路径。为此，他们首先将活跃的蛙类精子通过移液加入到 transwell 小室的上层。在下层则加入 allurin。在允许细胞迁移一段时间后，他们在显微镜下计数储液池溶液中的精子数量。利用该技术，他们绘制出一条浓度-反应曲线，展示了 allurin 浓度对精子迁移的影响。

当细胞受到病原体攻击时，会释放趋化因子以招募免疫细胞，这些免疫细胞会迁移至感染部位、附着并最终清除感染。为了验证这一现象，这些科学家在 transwell 小室的下侧培养了上皮细胞，随后用不同菌株的细菌感染这些细胞，最后将免疫细胞加入到上室中。已知被感染的细胞会产生多种趋化因子，诱导免疫细胞发生迁移。该实验结果表明，不同类型的细菌感染会引发不同程度的中性粒细胞迁移。

最后，癌细胞穿过细胞外基质的侵袭与转移现象一直吸引着细胞生物学家的关注。在此研究中，科学家希望确定特定趋化因子如何促进细胞在三维基质中的迁移。他们通过基因工程构建了两组不同的细胞：一组表达绿色荧光蛋白，另一组表达红色荧光蛋白。随后，他们将模拟细胞外基质的材料移液至 transwell 小室的上层。

待其凝固后，将 transwell 小室倒置，并将两组细胞接种于膜的下表面。接着，将小室重新放入多孔板中，并向顶部小室加入趋化因子溶液。这促使位于底部的细胞向上穿过三维基质迁移。借助共聚焦成像技术，这些研究人员重建了细胞在三维空间中的迁移过程，并区分了两组细胞的迁移模式。

您刚刚观看了 JoVE 关于 transwell 迁移实验的视频。通过了解该方法的组成部分和实验步骤，您现在知道为何细胞生物学家如此广泛地使用这一技术。尽管该装置看似简单，但该方法可适应多种配置，使其在细胞运动性研究中不可或缺。一如既往，感谢您的观看！