Annexin V 与碘化丙啶标记

细胞的膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（propidium iodide, PI）标记是一种用于识别细胞死亡并区分其不同途径的技术，包括凋亡（程序性细胞死亡）和坏死。不同死亡途径中，细胞会经历特定的形态学变化。通过鉴定导致细胞发生凋亡或坏死的具体条件，科研人员能够深入了解细胞生理学以及疾病的发生机制。结合流式细胞术，Annexin V与PI标记已被确立为最高效的细胞死亡类型分类方法之一。

本文将介绍该检测方法如何帮助识别细胞死亡途径、该技术的具体操作步骤，以及若干利用此方法解答细胞生物学领域重要科学问题的精彩实验实例。

首先，让我们了解一下annexin V和PI染色背后的原理。

如前所述，凋亡细胞表现出独特的形态学特征，包括细胞皱缩、膜出泡、核碎裂以及凋亡小体的出现。此外，在凋亡诱导后——即早期凋亡阶段——细胞膜上会出现某些特征性变化。正常细胞膜的所有磷脂酰丝氨酸（PS）残基均位于脂双层的内小叶。然而，在早期凋亡细胞中，部分PS残基会转位至膜的外表面——但这一过程是如何发生的呢？

要理解这一点，我们需要回溯一步。在凋亡过程中，胞质中的caspase被广泛证实会被激活。这些酶继而激活一种膜结合酶，称为scramblase。scramblase通过将PS残基从胞质侧转移至细胞膜外表面，从而“扰乱”细胞膜的不对称分布。相比之下，在坏死过程中，PS残基仍保留在原位，但细胞膜本身发生破裂。annexin V与PI标记正是利用了这两种细胞死亡方式在膜改变上的差异。

与荧光染料（如异硫氰酸荧光素，通常称为FITC）偶联的annexin V是一种不能穿透细胞膜的天然PS配体，因此可通过结合外翻的PS来快速识别早期凋亡细胞。然而，在细胞膜破裂后（这种情况发生在坏死以及凋亡晚期），annexin也能结合内侧暴露的PS，从而导致假阳性结果。

为了避免这一问题，科研人员会使用PI。这种DNA结合染料同样无法穿透完整细胞膜，只有在细胞膜破裂时才能进入细胞。因此，若一个细胞仅被annexin染色，则为早期凋亡细胞；而若一个细胞同时被PI和annexin染色，则可能是坏死细胞或晚期凋亡细胞。

现在您已经了解了该检测方法的基本原理，接下来让我们逐步介绍细胞死亡的染色与分析流程。

首先，收集细胞并在低速下离心，以避免造成任何形态学损伤，然后将细胞重悬于生理洗涤缓冲液中，例如磷酸盐缓冲液（PBS）。经过另一次离心后，将细胞重悬于含有钙离子的annexin V结合缓冲液中，因为钙离子是annexin与磷脂酰丝氨酸（PS）结合所必需的。随后向溶液中加入与FITC偶联的annexin V，并在室温避光条件下孵育，以使annexin与PS充分结合。下一步，直接将PI加入annexin染色后的细胞溶液中，并继续在避光条件下孵育。孵育结束后，通过离心用PBS洗涤细胞，再重悬于洗涤缓冲液中，并置于冰上保存。此时，细胞即可用于后续分析。

通过流式细胞术分析细胞的荧光活性，这是一种基于激光的技术，可从悬浮于液流中的单个细胞捕获荧光信号数据。在使用每种染料单独染色的细胞完成荧光校准后，采集双染细胞的数据。利用细胞群体的荧光信号绘制散点图，其中annexin结合的FITC荧光强度显示在对数X轴上，PI荧光强度显示在对数Y轴上。annexin-FITC阳性而PI阴性的细胞将聚集在图的右下象限，代表早期凋亡细胞；annexin-FITC和PI双阳性的细胞则位于右上象限，代表晚期凋亡或坏死细胞。而对annexin和PI均无染色或染色不明显的细胞则为活细胞。

既然您已经了解了细胞生物学家为何依赖该技术来研究细胞死亡，那么让我们回顾一下它的一些应用。

利用该方法，科学家可以追踪哪些细胞内蛋白参与了细胞凋亡过程。在本视频中，研究人员分析了抗癌药物顺铂对正常肾细胞的作用，以观察其是否诱导细胞凋亡。一组细胞被转导以过表达蛋白激酶C（protein kinase C，简称PKC）的活性形式，另一组则被转导表达非功能性形式——即显性负性PKC。表达PKC并经顺铂处理的细胞随时间推移发生了细胞凋亡，而表达失活型显性负性PKC的细胞则对细胞凋亡具有抗性，表明该酶在顺铂诱导的细胞凋亡通路中起关键作用。

研究人员还使用这些染料来检测特定T细胞的细胞毒性潜能。细胞毒性T细胞能够识别靶细胞上的特定膜蛋白，并在与其结合后诱导其死亡。在此实验中，研究人员将抗原特异性T细胞与靶肿瘤细胞及V型膜联蛋白（annexin V）共同孵育，随后观察到T细胞结合诱导了肿瘤细胞的凋亡。流式细胞术数据显示了在有或无细胞毒性T细胞存在条件下靶细胞死亡的百分比。

最后，科学家还利用该方法评估基因递送后的细胞活力。在此案例中，研究人员希望评估核转染（nucleofection）后的细胞存活情况——该方法通过化学试剂与外加电场的组合，在细胞膜和核膜上形成瞬时孔道，从而促进基因递送。通过联合使用V型膜联蛋白与一种名为7-氨基放线菌素D（7-aminoactinomycin D，简称7-AAD）的染料（其作用机制与PI类似，可结合DNA），研究人员证明核转染导致的细胞凋亡或坏死水平较低。

您刚刚观看了 JoVE 关于膜联蛋白 V 与碘化丙啶标记的视频。在本视频中，我们简要讨论了凋亡细胞与坏死细胞的区别特征，回顾了该方法背后的原理，观看了一般情况下这一常用技术的操作流程，并预览了一些应用实例。鉴于理解不同条件下各类细胞死亡方式的重要性，膜联蛋白 V 与碘化丙啶标记成为细胞生物学家研究这一现象的重要工具。一如既往，感谢您的观看！