Question 1

DNA片段化是什么？它是如何在细胞凋亡期间发生的？

Accepted Answer

DNA 片段化是一种细胞凋亡的标志，其中染色体 DNA 被切割成具有断链末端的片段。胞溶酶，一种存在于细胞质中的酶，通过移除其抑制剂来激活胞溶酶激活的去氧核糖核酸酶 (CAD)。活化的 CAD 移动到细胞核并切割染色体 DNA，创建积累并发出信号的片段 细胞死亡。

Question 2

TUNEL 检测法如何检测凋亡细胞？

Accepted Answer

TUNEL 检测法能荧光标记凋亡细胞中的切口 DNA 末端。末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化荧光标记的脱氧尿苷三磷酸（dUTP）核苷酸附着到碎片化 DNA 上的自由 3' 羟基。这创造了在荧光显微镜下可见的 TUNEL 阳性细胞。

Question 3

在组织切片上进行TUNEL检测的主要步骤是什么？

Accepted Answer

TUNEL 检测协议包括使用 4% 的巴甲醛固定组织，冷冻切片成 10 µm 厚度，用蛋白酶 K 进行渗透，加入 TdT 酶和标记的 dUTPs，在 37°C 下孵育 1-3 小时，用停止缓冲液终止反应，并使用荧光显微镜进行可视化。

Question 4

为什么在添加TUNEL试剂之前需要进行组织透化处理？

Accepted Answer

渗透剂允许TUNEL试剂，特别是TdT酶，渗透细胞核并接触到碎片化的DNA。在37°C下用蛋白酶K处理5-15分钟会在细胞膜上创造孔洞，使酶能够到达核内的底物。

Question 5

研究人员如何使用TUNEL染色来研究疾病中的细胞凋亡？

Accepted Answer

研究人员应用TUNEL染色来检查各种疾病背景下的细胞凋亡。例如，科学家使用它来评估肿瘤对药物的反应性，方法是用实验化合物处理人类肿瘤样本并测量细胞凋亡的增加。TUNEL染色通过计算组织切片中TUNEL阳性细胞的百分比来量化细胞死亡。

Question 6

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶在启动DNA片段化中扮演什么角色？

Accepted Answer

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶是存在于细胞质中的蛋白水解酶，通过切割细胞蛋白执行细胞凋亡。它们通过将半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活化的脱氧核糖核酸酶（CAD）从其抑制剂ICAD中分离出来来活化CAD。一旦被激活，CAD进入细胞核并切割染色体DNA，产生TUNEL检测到的碎片化DNA。

Question 7

TUNEL 阳性染色对组织样本中的细胞表示什么？

Accepted Answer

TUNEL 阳性细胞正在经历细胞凋亡，并包含被荧光 dUTP 标记的具有断裂末端的 DNA 片段。这些细胞在显微镜下显示荧光，表明程序性细胞死亡。计数 TUNEL 阳性细胞可提供组织切片中发生的细胞凋亡的定量测量。

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