ATP 生物发光检测
在萤火虫中，荧光素酶能将一种称为荧光素的化合物转化为氧化荧光素，并在此过程中产生光，即“生物发光”。该反应需要来自ATP的能量才能进行，因此研究人员利用荧光素酶与荧光素的相互作用来测定细胞中的ATP水平。鉴于ATP作为细胞能量“货币”的作用，ATP生物发光检测可为细胞代谢及整体细胞健康状况提供重要信…
ATP 生物发光检测是一种常用的技术，用于定量检测 ATP 水平并识别存活且具有代谢活性的细胞。ATP（即三磷酸腺苷）是所有生物体的主要能量来源，这里的“所有”指的是所有生物。在细胞水平上，ATP 通过一组称为细胞呼吸的代谢过程生成。
今天，我们将简要讨论细胞呼吸中涉及的代谢通路。接着，我们将介绍 ATP 生物发光检测的基本原理，并逐步讲解该方法的操作流程。最后，我们将了解科学家如何在当前研究中应用这一技术。
首先介绍细胞呼吸。这一现象涉及多个代谢过程，但我们将重点关注与葡萄糖代谢相关的部分。
在细胞质中，糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸，并在此过程中生成两个ATP分子。丙酮酸被转运至线粒体，在那里转化为乙酰辅酶A——此过程同时产生二氧化碳。仍在线粒体内，乙酰辅酶A随后进入三羧酸（TCA）循环，在此过程中再次产生二氧化碳，同时生成高能分子NADH和FADH2。这些分子最终将电子“携带”至电子传递链（ETC）。
在ETC中，电子在线粒体内膜的不同蛋白质复合物之间依次传递，最终将氧气转化为水。在此过程中，质子被“泵”入线粒体膜间隙。当这些质子通过一种称为ATP合酶的蛋白质返回线粒体基质时，便生成了ATP。TCA循环与ETC共同作用，最终合成36个ATP分子。其他营养物质分子（如脂肪和蛋白质）的分解也可进入TCA循环和ETC，从而产生ATP。
现在我们已经了解了细胞如何生成 ATP，接下来学习 ATP 生物发光检测法的基本原理，该方法常用于测定细胞内这种分子的含量。
从结构上看，ATP 包含一个腺嘌呤碱基、一个核糖以及三个磷酸基团，其中后三者通过高能键相连。这些高能键在断裂时会释放能量，而 ATP 生物发光检测正是利用了这一能量。
该检测方法主要需要一种称为荧光素的化合物，它来源于萤火虫等“发光”生物，以及其对应的催化酶——荧光素酶。在氧气存在的情况下，荧光素酶利用 ATP 提供的能量，将荧光素转化为氧化荧光素。该反应的副产物包括焦磷酸盐（即来自 ATP 的两个磷酸基团，使 ATP 转化为腺苷一磷酸或 AMP）、二氧化碳以及光（即发光）。发光信号由化学发光仪读取，这是一种可定量检测光发射的仪器。由于所产生的发光强度与 ATP 含量成正比，因此该检测可有效反映细胞活力和代谢水平。
了解了ATP生物发光检测的原理后，下面我们概述一个通用的实验方案。
首先，将细胞接种于含有培养基的96孔板中。为考虑密度依赖性差异，细胞以不同密度设置三个重复孔进行接种。由于最外圈的孔在四个侧面并非全部被其他孔包围，其温度和蒸发速率可能不稳定。因此，不在外圈孔中接种细胞，而是将这些孔加水填充，以避免整块板出现蒸发和温度变化，从而影响反应结果。随后，将板在37°C条件下孵育过夜，使细胞充分贴附于培养板表面。
接着，移除培养基，向每个孔中加入荧光素酶和荧光素，并将板置于摇床上震荡5–15分钟，以促进反应进行。然后，将各孔中的部分混合液转移至白色的96孔板中；通常使用白色板，因其可向上反射光线，从而获得更准确的发光信号读数。此外，应避免产生气泡，因为气泡可能干扰后续分析。由于发光信号可能随时间衰减，需在加入试剂后10–12分钟内使用发光仪进行检测。
分析发光仪结果时，需计算相同细胞密度孔的平均发光值。通过比较健康对照样本与处理后细胞以此方式获得的发光数据，研究人员可评估特定处理对细胞活力和代谢的影响——具体可通过观察实验组中发光信号是否降低来判断。
现在您已经了解了如何进行ATP生物发光检测，接下来让我们讨论其在科研中的应用。
科学家们始终致力于开发不会损害或杀死宿主细胞的新型抗病毒药物。在本研究中，将哺乳动物细胞接种于多孔板中，并用特定病毒进行感染。向这些样本中加入多种抗病毒化合物，生成对数浓度-反应曲线，以计算半数有效浓度（EC50）。EC50是指细胞存活率为50%时化合物的浓度，是评估化合物细胞毒性的常用参数。
ATP 水平也可为不同条件下线粒体活性提供线索。在此，研究人员对来自啮齿类动物肝脏和肌肉细胞的线粒体样品进行了ATP生物发光检测，从而评估正常组织中线粒体功能的程度。重要的是，该方案可进一步拓展，用于研究疾病状态下线粒体功能的变化。
科学家们还利用该检测方法研究潜在的癌症治疗方法 体内 系统。在此示例中，人源肿瘤细胞经改造后表达荧光素酶，并被注射到活体小鼠的脑内。待肿瘤细胞在动物体内定植后，给予抗肿瘤药物治疗。随后 体内 ATP生物发光检测显示，药物暴露小鼠中的肿瘤细胞ATP水平较低。
您刚刚观看了 JoVE 关于 ATP 生物发光检测的简介。现在，您应该已经熟悉细胞呼吸途径以及用于检测作为这些途径终产物的 ATP 的实验方案。ATP 生物发光检测是细胞生物学家研究生理和病理因素对细胞代谢及细胞活力影响的理想筛选工具。一如既往，感谢您的观看！
ATP 生物发光检测是一种常用的技术，用于定量检测 ATP 水平并识别存活且具有代谢活性的细胞。ATP（即三磷酸腺苷）是所有生物体的主要能量来源，这里的“所有”指的是所有生物。在细胞水平上，ATP 通过一组称为细胞呼吸的代谢过程生成。
今天，我们将简要讨论细胞呼吸中涉及的代谢通路。接着，我们将介绍 ATP 生物发光检测的基本原理，并逐步讲解该方法的操作流程。最后，我们将了解科学家如何在当前研究中应用这一技术。
首先介绍细胞呼吸。这一现象涉及多个代谢过程，但我们将重点关注与葡萄糖代谢相关的部分。
在细胞质中，糖酵解途径将葡萄糖转化为丙酮酸，并在此过程中生成两个ATP分子。丙酮酸被转运至线粒体，在那里转化为乙酰辅酶A——此过程同时产生二氧化碳。仍在线粒体内，乙酰辅酶A随后进入三羧酸（TCA）循环，在此过程中再次产生二氧化碳，同时生成高能分子NADH和FADH2。这些分子最终将电子“携带”至电子传递链（ETC）。
在ETC中，电子在线粒体内膜的不同蛋白质复合物之间依次传递，最终将氧气转化为水。在此过程中，质子被“泵”入线粒体膜间隙。当这些质子通过一种称为ATP合酶的蛋白质返回线粒体基质时，便生成了ATP。TCA循环与ETC共同作用，最终合成36个ATP分子。其他营养物质分子（如脂肪和蛋白质）的分解也可进入TCA循环和ETC，从而产生ATP。
现在我们已经了解了细胞如何生成 ATP，接下来学习 ATP 生物发光检测法的基本原理，该方法常用于测定细胞内这种分子的含量。
从结构上看，ATP 包含一个腺嘌呤碱基、一个核糖以及三个磷酸基团，其中后三者通过高能键相连。这些高能键在断裂时会释放能量，而 ATP 生物发光检测正是利用了这一能量。
该检测方法主要需要一种称为荧光素的化合物，它来源于萤火虫等“发光”生物，以及其对应的催化酶——荧光素酶。在氧气存在的情况下，荧光素酶利用 ATP 提供的能量，将荧光素转化为氧化荧光素。该反应的副产物包括焦磷酸盐（即来自 ATP 的两个磷酸基团，使 ATP 转化为腺苷一磷酸或 AMP）、二氧化碳以及光（即发光）。发光信号由化学发光仪读取，这是一种可定量检测光发射的仪器。由于所产生的发光强度与 ATP 含量成正比，因此该检测可有效反映细胞活力和代谢水平。
了解了ATP生物发光检测的原理后，下面我们概述一个通用的实验方案。
首先，将细胞接种于含有培养基的96孔板中。为考虑密度依赖性差异，细胞以不同密度设置三个重复孔进行接种。由于最外圈的孔在四个侧面并非全部被其他孔包围，其温度和蒸发速率可能不稳定。因此，不在外圈孔中接种细胞，而是将这些孔加水填充，以避免整块板出现蒸发和温度变化，从而影响反应结果。随后，将板在37°C条件下孵育过夜，使细胞充分贴附于培养板表面。
接着，移除培养基，向每个孔中加入荧光素酶和荧光素，并将板置于摇床上震荡5–15分钟，以促进反应进行。然后，将各孔中的部分混合液转移至白色的96孔板中；通常使用白色板，因其可向上反射光线，从而获得更准确的发光信号读数。此外，应避免产生气泡，因为气泡可能干扰后续分析。由于发光信号可能随时间衰减，需在加入试剂后10–12分钟内使用发光仪进行检测。
分析发光仪结果时，需计算相同细胞密度孔的平均发光值。通过比较健康对照样本与处理后细胞以此方式获得的发光数据，研究人员可评估特定处理对细胞活力和代谢的影响——具体可通过观察实验组中发光信号是否降低来判断。
现在您已经了解了如何进行ATP生物发光检测，接下来让我们讨论其在科研中的应用。
科学家们始终致力于开发不会损害或杀死宿主细胞的新型抗病毒药物。在本研究中，将哺乳动物细胞接种于多孔板中，并用特定病毒进行感染。向这些样本中加入多种抗病毒化合物，生成对数浓度-反应曲线，以计算半数有效浓度（EC50）。EC50是指细胞存活率为50%时化合物的浓度，是评估化合物细胞毒性的常用参数。
ATP 水平也可为不同条件下线粒体活性提供线索。在此，研究人员对来自啮齿类动物肝脏和肌肉细胞的线粒体样品进行了ATP生物发光检测，从而评估正常组织中线粒体功能的程度。重要的是，该方案可进一步拓展，用于研究疾病状态下线粒体功能的变化。
科学家们还利用该检测方法研究潜在的癌症治疗方法 体内 系统。在此示例中，人源肿瘤细胞经改造后表达荧光素酶，并被注射到活体小鼠的脑内。待肿瘤细胞在动物体内定植后，给予抗肿瘤药物治疗。随后 体内 ATP生物发光检测显示，药物暴露小鼠中的肿瘤细胞ATP水平较低。
您刚刚观看了 JoVE 关于 ATP 生物发光检测的简介。现在，您应该已经熟悉细胞呼吸途径以及用于检测作为这些途径终产物的 ATP 的实验方案。ATP 生物发光检测是细胞生物学家研究生理和病理因素对细胞代谢及细胞活力影响的理想筛选工具。一如既往，感谢您的观看！
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does ATP bioluminescence assay measure cell viability?
The ATP bioluminescence assay uses luciferase enzyme to convert luciferin into oxyluciferin, producing light proportional to ATP levels. Since ATP reflects cellular metabolism and energy status, luminescence intensity directly indicates cell viability. A luminometer quantifies light emission, allowing researchers to assess whether cells are metabolically active or compromised by treatment or disease.
Q2: What role does ATP play in cellular respiration?
ATP is the primary energy currency produced through cellular respiration, a series of metabolic processes including glycolysis, the TCA cycle, and the electron transport chain. Glycolysis generates two ATP molecules, while the TCA cycle and electron transport chain together produce 36 ATP molecules. This energy powers all cellular functions in living organisms.
Q3: Why are outer wells filled with water in the ATP bioluminescence assay protocol?
Outer wells in a 96-well plate lack surrounding wells on all sides, causing variable temperature and evaporation rates. Filling these wells with water prevents plate-wide evaporation and temperature fluctuations that could interfere with the assay reaction and compromise luminescence readings from experimental wells.
Q4: What is EC50 and how does it relate to antiviral compound testing?
EC50 is the concentration of a compound at which cell viability drops to 50 percent, serving as a standard parameter to assess cytotoxicity. In antiviral research, scientists use the ATP bioluminescence assay to generate concentration-response curves and calculate EC50 values, helping identify effective antiviral compounds that minimize harm to host cells.
Q5: How does the luciferase-luciferin reaction produce luminescence?
Luciferase enzyme uses energy from ATP to convert luciferin into oxyluciferin in the presence of oxygen. This reaction releases byproducts including pyrophosphate, carbon dioxide, and light or luminescence. The amount of light produced is directly proportional to ATP concentration, making it a reliable indicator of cellular energy status.
Q6: Why are white 96-well plates preferred for luminescence measurements?
White 96-well plates reflect light upward toward the luminometer detector, enabling more accurate and sensitive luminescence readings compared to other plate colors. This reflective property maximizes signal detection and reduces background noise, improving the reliability of ATP quantification in the assay.
Q7: How can the ATP bioluminescence assay reveal mitochondrial function in disease states?
The assay measures ATP production, which directly reflects mitochondrial activity and oxidative phosphorylation efficiency. By comparing ATP levels in healthy tissue mitochondria versus diseased preparations, researchers can assess whether mitochondrial dysfunction contributes to pathological conditions, providing insights into metabolic disruption in disease.