检测活性氧物种

细胞内产生的活性氧（ROS）与组织稳态、细胞衰老以及癌症等疾病状态密切相关。顾名思义，这些分子来源于氧，而氧在自然界中通常以稳定的双原子氧分子形式存在，因其所有电子均成对排列。当加入一个未成对电子后，氧分子变得不稳定，从而形成超氧阴离子——一种活性氧（ROS）。除超氧阴离子外，还存在多种含未成对电子的活性物质，细胞会严格调控这些物质的水平。

在本视频中，我们将学习活性氧与细胞代谢及疾病之间的关系，探讨利用荧光探针检测活性氧的实验原理，并概述该检测方法的一般性操作流程。最后，我们还将了解当前科研人员如何在实验中应用这一技术。

首先，让我们讨论活性氧是如何产生的，以及它们在细胞代谢和疾病中的影响。

细胞内活性氧的一个重要来源是线粒体。正常情况下，在细胞代谢过程中，电子会通过一系列蛋白质复合物传递，最终将分子氧还原为水，同时生成ATP。尽管这一过程受到高度调控，但仍会有电子泄漏，从而形成超氧阴离子。

超氧阴离子的出现会迅速引发其他形式的活性氧，例如过氧化氢和羟基自由基。这些自由基均含有高度反应性的未成对电子，可对细胞膜、DNA和蛋白质造成氧化损伤。为对抗这一过程，细胞自身维持着抗氧化酶类（如超氧化物歧化酶）或抗氧化分子（如维生素C）的储备，以清除自由基。若此防御系统失衡，可能导致致命的正反馈循环，从而引发活性氧过度积累的状态，即氧化应激。

活性氧已被证实参与癌症的发生与发展。这些分子的另一种有害作用是诱导细胞衰老，也称为细胞老化。“自由基衰老理论”提出，细胞在正常代谢过程中产生的活性氧会引发细胞衰老和死亡。

到目前为止，我们讨论了这些高反应性分子的负面作用，但它们在细胞生理中也具有积极作用。在免疫应答过程中，当吞噬细胞吞噬病原体时，细胞会启动“呼吸爆发”，在此期间产生大量活性氧，以氧化降解病原体。此外，活性氧还是多种细胞信号通路所必需的中间产物和调节因子，甚至可向已癌变的细胞传递死亡信号。

为了定量这些具有重要影响的细胞氧化剂，科学家利用某些分子，这些分子在被氧化后会发出荧光。一种常用于检测活性氧物质的探针是 H₂DCFDA（二氯二氢荧光素二乙酸酯），它是荧光素的一种非荧光类似物。当将其加入细胞后，由于其具有细胞膜通透性，可被动扩散进入细胞内。

随后，细胞内的酯酶催化水解反应，导致乙酸基团被切除。这一过程使化合物极性增强，因而被保留在细胞内。在氧化过程中，多种活性氧物质可移除氢原子，使原本无荧光的 H2DCFDA 转变为高度荧光的二氯荧光素（DCF）。该荧光信号可通过酶标仪、流式细胞仪或荧光显微镜进行检测和定量。

现在您已经了解了该检测方法的原理，接下来让我们看看如何在实验室环境中进行操作。

首先将培养基中培养的细胞转移至磷酸盐缓冲液中，随后通过离心洗涤细胞。去除上清液后，加入荧光探针 H₂DCFDA 溶液。将负载染料的细胞在避光条件下孵育，以防止光漂白。孵育结束后，洗涤细胞以去除未进入细胞的染料，并将细胞转移至检测板中。此时可加入实验所需的氧化应激诱导剂。

当准备进行分析时，可将检测板放入酶标仪中。设定激发波长和发射波长以适配荧光素。读板完成后，即可对所得数值进行分析。结果将显示在特定时间点下各样本间活性氧相对含量的差异。

在了解了具体的实验方案之后，让我们来看看这一方法在当前实验中的应用情况。

研究人员常使用该方法研究吞噬作用的机制。这组科学家希望探究斑马鱼在不同发育阶段启动免疫反应的能力。如前所述，吞噬作用会产生活性极高的活性氧（ROS），即“呼吸爆发”，用于杀灭病原体。由于NADPH氧化酶是吞噬细胞中重要的活性氧产生酶，这些科学家通过使用NADPH诱导剂处理斑马鱼，诱导其产生呼吸爆发反应。实验结果表明，在被诱导产生“爆发”反应的斑马鱼胚胎中，受精后72小时的胚胎比受精后48小时的胚胎表现出更高的活性氧生成水平。

由于活性氧增加导致的线粒体功能障碍是多种疾病的病理特征。因此，研究人员可通过检测氧化应激水平来识别线粒体功能障碍。在此实验中，科学家将H2DCFDA加载到神经元中，随后将样本置于荧光显微镜下观察。当加入过氧化氢等氧化应激诱导物后，细胞体出现荧光信号的急剧增强，这可能提示存在线粒体功能障碍。

已有研究提示星形胶质细胞具有保护中枢神经系统神经元免受氧化应激损伤的作用。鉴于其重要性，这些研究人员旨在建立一种检测星形胶质细胞在外界诱导剂存在下发生氧化应激的实验方法。他们通过将星形胶质细胞与过氧化氢及用于检测活性氧的荧光探针共同孵育，随后利用流式细胞仪分析所产生的荧光信号。结果显示，发生氧化应激激活的星形胶质细胞出现在荧光强度增强的区域，表现为向右偏移。

您刚刚观看了 JoVE 关于检测活性氧（ROS）的视频。总结一下，本视频中我们讨论了活性氧、细胞代谢与疾病之间的关联。随后，我们探讨了活性氧检测实验的原理和操作步骤。最后，我们了解了研究人员如何将这一方法应用于他们的研究中。活性氧所扮演的尚不完全明确的角色，引起了细胞生物学家的广泛关注，而利用荧光探针进行可靠检测正被证明具有不可估量的价值。一如既往，感谢观看！