组织型组织培养

组织型组织培养技术可使细胞在三维环境中生长，从而构建出在形态和功能上均接近真实组织的体外组织模型，这些模型可作为组织修复的有效构建物。这类培养物通常是高密度培养的单一细胞类型所形成的三维结构。这种三维结构也被称为支架，可模拟天然的细胞外基质。根据所使用的细胞类型，支架可被设计用于特定用途，通常作为生物仿生组织的模板。本视频将介绍组织型组织培养的基本原理、细胞分离方法，以及多孔丝素蛋白组织支架的制备与细胞接种，以模拟心肌组织。

所有组织均由两个基本组分构成：细胞外基质以及栖居于其中的组织特异性细胞。细胞外基质是由结构性蛋白构成的网络，为细胞提供三维微环境；而其中的细胞则用于重现组织的天然生理过程。目前，常用的组织建模技术是二维组织培养，即将细胞接种于平坦的基底表面，使其形成一层薄膜。通常情况下，该方法难以稳定维持细胞的体内表型、器官特异性功能以及细胞间或细胞与基底间的微环境相互作用。组织类组织培养通过为细胞提供三维支架，克服了上述局限性，从而形成致密的细胞网络，更接近天然细胞形态，并促进真实细胞间网络及信号通路的建立。多种三维聚合物网络（包括水凝胶和静电纺丝素膜）为组织特异性细胞的三维培养提供了便捷途径。为使细胞在这些支架上生长，必须首先分离细胞。本视频中所用的原代细胞来源于活体组织，经剪碎后在酶溶液中消化，以将目标细胞从细胞外基质中分离出来。细胞分离完成后，有两种常用方法用于在支架上接种细胞。滴加法是通过移液器以缓慢且恒定的速率将细胞悬液滴加至支架表面；第二种方法即细胞悬液法，是将支架完全浸没于细胞悬液中。通常会对支架与悬液进行震荡，以促进细胞向基质内部迁移。两种方法均可获得细胞密度较高的生物工程化构建体。以下操作将涉及心肌细胞的分离以及采用细胞悬液法构建心肌细胞特异性支架，因其可保留天然心肌组织的形态结构。

开始从供体组织中分离细胞时，首先确保工作区域和解剖器械已灭菌。然后，在生物安全柜内的工作台面上铺放无菌铺巾。将无菌外科器械放置于铺巾上，避免触碰，随后打开一把无菌的20号手术刀片。对样本实施安乐死后，使用浸有碘伏的纱布垫消毒手术区域。准备就绪后，固定样本并开始手术以分离目标组织。本例中，目标组织为心脏。将心脏切除后，立即置于含有PBS葡萄糖的培养皿中并置于冰上。去除残留的血液或结缔组织，然后将组织转移至另一含有新鲜PBS葡萄糖的培养皿中。接着，使用无菌显微剪刀和镊子，小心地将组织样本剪切成大约1立方毫米大小的组织块。使用移液器将组织块和缓冲液转移至一个锥形管中。保留10毫升缓冲液，其余全部移除。加入7毫升胶原酶溶液，随后在37摄氏度下震荡7分钟。然后，轻柔吹打10次以进一步分散组织块。静置使组织块沉降，随后吸去上清液并弃除。接下来，重复消化步骤，并再次轻柔吹打溶液以进一步解离组织块。待组织块沉降后，吸出上清液，并收集至另一个50毫升锥形管中。然后，向每个含有上清液的锥形管中加入10毫升终止液，以终止消化反应。

现在原代细胞已经分离完毕，接下来让我们制备一种多孔丝素组织支架。首先，将30毫升丝素溶液倒入模具中。接着，将60克过筛的氯化钠均匀撒在溶液表面。然后，在室温下静置48小时，使丝素充分聚合。随后，将模具放入60°C的烘箱中加热1小时，以完成交联并蒸发残留液体。聚合完成后，将模具浸入盛有蒸馏水的烧杯中，浸泡48小时以浸出盐分。之后，将支架从模具中取出，使用5毫米活检打孔器切割成小圆片。将这些圆片修整至2毫米高度，再用2毫米活检打孔器去除每片的中心部分，形成环状结构。最后，将支架在湿润循环条件下高压灭菌20分钟。

支架制备完成后，开始进行细胞接种。首先，在96孔板的每个孔中各放入一个无菌支架。然后加入细胞培养基以浸没支架，并在37摄氏度的组织培养孵箱中孵育至少30分钟，使支架充分平衡。孵育结束后，吸去多余培养基，随后将分离得到的原代细胞悬液加入支架中。接着，将培养板放回孵箱中过夜，使细胞充分贴附于支架上。次日早晨，小心吸去未贴附的细胞，并为每个孔更换200微升新鲜的细胞培养基。最终获得的支架即为一种具有高细胞密度的多孔结构，可直接用于后续实验。

现在您已经学习了如何进行组织型组织培养，接下来让我们探讨这些材料的一些实际应用。组织型组织培养能够创建模拟天然组织的细胞微环境，因此可为单一种类细胞的行为研究提供合适的模型。例如，三维支架中的纤维能够更准确地模拟体内存在的干细胞微环境，可接种多能干细胞以筛选生物学信号因子，并确定这些因子对干细胞分化的影响。这项研究最终可能加深我们对干细胞分化机制的理解，并为组织工程应用中增强细胞分化与再生提供新思路。与动态培养类似，机械刺激也可通过施加类似于天然组织在体内所承受的各种机械负荷，来增强三维组织支架的性能。在细胞生长过程中施加压缩力和双轴负荷，可改变细胞形态和细胞外基质，使其响应并反映所受的机械刺激。由此获得的预处理生物工程组织支架，其细胞结构更接近天然组织，因此非常适合植入可能承受类似机械力的部位。最后，工程化组织构建物还可用于替代或修复组织缺损。为实现这一目标，首先必须使组织支架实现血管化，从而允许血液在构建物中自由流动。一旦完成血管化，即可将支架转移并植入组织缺损区域以启动修复过程。后续可通过组织学分析确认移植是否成功，以判断组织构建物是否完全修复了受损区域。

您刚刚观看了 JoVE 关于组织型组织培养的介绍。现在您应该了解了如何制备简单的三维结构，如何分离原代细胞并将其接种到支架上，以及这些培养物在生物工程领域中的各种应用。感谢观看。