Name: 基于多重 CRISPR 增强器的细胞系干扰增强功能解剖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学习使用SID4X-dCas9-KRAB融合蛋白进行多重增强子靶向干扰的方法，通过E-CRISP设计向导RNA并在Ishikawa细胞中实现基因表达调控。该技术可快速鉴定调控特定基因的增强子区域，为基因组学和基因调控研究提供高效工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由J.G.获得的美国国立卫生研究院/国家人类基因组研究所（NIH/NHGRI）R00 HG006922项目和R01 HG008974项目以及亨茨曼癌症研究所资助。J.B.C. 受美国国立卫生研究院遗传学培训项目（NIH Training Program in Genetics）T32GM007464资助。

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li>
<li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li>
<li>Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shadow+enhancers+foster+robustness+of+Drosophila+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation.</a> Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).</li>
<li>Lam, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+redundant+enhancers+cooperatively+maintain+Mammalian+pomc+expression+above+a+critical+functional+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold.</a> PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Savic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-distal+RNA+polymerase+II+binding+discriminates+active+from+inactive+CCAAT%2F+enhancer-binding+protein+beta+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites.</a> Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on%2C+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li>
<li>Hilton, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenome+editing+by+a+CRISPR-Cas9-based+acetyltransferase+activates+genes+from+promoters+and+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.</a> Nat Biotechnol. , (2015).</li>
<li>Kearns, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+native+enhancers+with+a+Cas9-histone+demethylase+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion.</a> Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).</li>
<li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li>
<li>Groner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KRAB-zinc+finger+proteins+and+KAP1+can+mediate+long-range+transcriptional+repression+through+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading.</a> PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
<li>Fulco, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+functional+enhancer-promoter+connections+with+CRISPR+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference.</a> Science. 354 (6313), 769-773 (2016).</li>
<li>Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li>
<li>Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Engineering+and+Analysis+of+Combinatorial+Enhancer+Activity+in+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells.</a> Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).</li>
<li>Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Enhancer+Interference+Reveals+Collaborative+Control+of+Gene+Regulation+by+Estrogen+Receptor+alpha-Bound+Enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers.</a> Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad+proteins+contain+a+dominant+transcription+repression+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mad proteins contain a dominant transcription repression domain.</a> Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).</li>
<li>Alland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+N-CoR+and+histone+deacetylase+in+Sin3-mediated+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression.</a> Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).</li>
<li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li>
<li>Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+repression+of+AXIN2+and+MYC+gene+expression+using+designer+TALEs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).</li>
<li>Stampfel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+form+diverse+groups+with+context-dependent+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions.</a> Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).</li>
<li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li>
<li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-CRISP%3A+fast+CRISPR+target+site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li>
<li>Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Inducible+CRISPR-dCas9-KRAB+Effector+System+to+Dissect+Transcriptional+Regulation+in+Human+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).</li>
<li>Romanienko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Vector+with+a+Single+Promoter+for+In+Vitro+Transcription+and+Mammalian+Cell+Expression+of+CRISPR+gRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs.</a> PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).</li>
<li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+RNAi+and+CRISPR+technologies+by+large-scale+gene+expression+profiling+in+the+Connectivity+Map%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map.</a> PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).</li>
<li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li>
<li>O'Geen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCas9-based+epigenome+editing+suggests+acquisition+of+histone+methylation+is+not+sufficient+for+target+gene+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression.</a> Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).</li>
<li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种简单且灵活的方法，用于在内源基因组位点上解析增强子功能，而无需对DNA序列进行物理性改造。尽管该方法在概念上与先前发表的使用dCas9-KRAB27的CRISPR干扰方案相似，但增强子干扰（Enhancer-i）在三个方面与这些方案存在主要差异。首先，Enhancer-i利用MAD1的SIN3A相互作用域20实现增强子失活。使用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂可逆转增强子的失活，表明其失活的主要机制依赖于HDAC。与使用dCas9-KRAB的CRISPR干扰不同，Enhancer-i不会导致H3K9me3的沉积。这可能是因为Enhancer-i依赖于向导RNA的瞬时导入，并在转染后3天收获细胞；而在CRISPR干扰中，转导后7天可观察到H3K9me3水平升高12。最后，Enhancer-i方案提供了一种可同时靶向多个位点并监测靶向效率的策略。在Mosaic-seq17中，虽然也使用dCas9-KRAB同时靶向多个增强子，但该技术依赖单细胞RNA测序来识别基因表达变化，由于单细胞RNA-seq灵敏度较低，许多基因（如雌激素响应基因）无法被检测到。Enhancer-i为研究任意基因的增强子提供了可靠的方法，既可单独分析，也可组合分析。
Enhancer-i 实验中最关键的步骤是转染，应针对目标细胞系对转染条件进行优化。本方案依赖嘌呤霉素处理来富集转染细胞，但共转染向导RNA与荧光蛋白，并通过流式细胞术分选荧光阳性细胞，可能对某些细胞类型而言是更优的富集方法。我们建议通过qPCR检测向导RNA和SID4x-dCas9-KRAB的表达水平，以排查问题并确认转染效果。若向导RNA水平较低（循环阈值） &#62;30），用户还可考虑其他向导RNA制备策略，例如 体外 转录28也有可能尽管gRNA水平较高，但向导RNA对SID4x-dCas9-KRAB蛋白的靶向效率较低，此时可能需要选择不同的向导RNA序列。通过在染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）中使用经Enhancer-i处理细胞的染色质与融合蛋白进行检测，可监控靶向效率。若在目标区域检测到较强的SID4x-dCas9-KRAB信号，但其假定靶基因的表达未发生改变，则表明该区域在所研究的条件下可能不参与调控该基因的表达。
Enhancer-i 的一个潜在局限性在于，如果同时靶向过多位点，可能会累积脱靶效应。尽管如此，与RNAi相比，用于基因敲低的CRISPR干扰策略具有更少的脱靶效应29，尤其是在使用表达dCas9-KRAB的多克隆细胞系时。虽然我们在同时靶向10个位点时观察到了SID4X-dCas9-KRAB的脱靶基因组结合现象，但尚未发现这些结合事件导致了基因表达的变化。由于某些增强子可能与多个启动子和/或其他增强子发生相互作用，因此靶向单个增强子可能导致多个基因的表达发生变化，但目前尚不清楚这种形式的基因调控是否普遍存在。为了确认所观察到的表达变化是由特异性靶向某一增强子引起而非脱靶效应所致，用户可针对同一区域使用两组不同的非重叠向导RNA进行Enhancer-i实验。此外，利用具有核酸酶活性的Cas9对该区域进行基因敲除，可进一步验证其对基因表达的影响。
由于Enhancer-i通过组蛋白去乙酰化发挥作用，其失活能力可能仅限于具有显著组蛋白乙酰化水平的增强子。存在多种其他抑制性融合蛋白，可能在靶向特定增强子时更为有效。将DNA甲基转移酶与dCas9融合后，当靶向远端增强子时可降低基因表达30，但这种抑制通常不具备瞬时性。另一种抑制性融合蛋白利用GATA1的伴侣蛋白（Friend of GATA1, FOG1）结构域，可导致组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化，并在多种细胞系和启动子上实现与dCas9-KRAB相当的基因表达抑制水平31。有趣的是，在dCas9上增加FOG1拷贝数反而会降低其在启动子处的抑制潜力，提示单个SID结构域可能比Enhancer-i当前使用的4个拷贝提供更强的增强子失活效果。某些基因座可能受益于上述dCas9融合蛋白的不同组合进行双重靶向。例如，同时转导dCas9-DNMT3a和dCas9-KRAB可实现稳定且长期的基因抑制32。目前大多数抑制性融合蛋白仅被用于单个基因座的靶向，尚不清楚哪一种在同时调控多个增强子时最为有效。
增强子-i技术虽然适用于研究少数基因的增强子组合，但如果用户希望研究数百个基因的潜在增强子，则其通量仍有一定局限性。该技术未来的应用将结合基于成像的技术，以同时定量多个样本中的多个基因。重要的是，这些技术可与来自裂解液的RNA分子直接检测兼容，从而无需耗时的RNA分离步骤。这些改进将有助于对更大规模的增强子集合进行功能解析。

ENCODE1、Roadmap Epigenomics2 和 FANTOM3 等大规模测序项目已在数百种细胞类型中鉴定了人类基因组中数百万个潜在的增强子。据估计，每个启动子平均与4.9个增强子相关联，而每个增强子平均与2.4个基因发生相互作用3，这表明基因表达通常是多个分散调控相互作用整合的结果。目前仍存在一个重要挑战，即不仅需要明确单个增强子如何影响基因表达，还需阐明它们如何协同作用以调控基因表达。遗传学方法通常用于在从果蝇（Drosophila）4 到小鼠5 等模式生物中鉴定增强子之间的关系。然而，这些实验在研究多个基因上的多个增强子时耗时较长且通量较低。
大规模研究增强子功能的一种方法是采用高通量并行报告基因检测。这类检测能够同时筛选成千上万条DNA序列驱动报告基因表达的能力6。尽管这些检测表明，仅DNA序列本身就足以传递基因调控信息7，但其局限性在于检测是在非天然的染色质环境之外进行的，并且使用了异源启动子。此外，高通量并行报告基因检测中所分析的DNA序列长度通常小于200个碱基对，可能遗漏相关的邻近序列。更重要的是，由于报告基因检测一次只能测量一条序列的活性，因此无法反映增强子之间可能存在的复杂相互关系。因此，尽管高通量并行报告基因检测能够揭示DNA序列的内在活性，却未必能反映该DNA序列在基因组环境中的真实功能。
近年来开发的 CRISPR/Cas9 工具8 促进了基因调控的研究，因其能够在内源性位点上删除增强子。然而，同时删除多个增强子可能导致基因组不稳定，且在单个细胞系中连续生成多个增强子缺失耗时较长。此外，在修复后，缺失位点会形成新的基因组序列，这些新序列可能获得调控功能。一种 Cas9 的改良版本已被专门开发用于调控基因表达，该版本依赖于将激活9,10 或抑制11,12 结构域融合至核酸酶失活的 Cas9（dCas9）上。这些融合蛋白非常适合同时研究多个基因位点，因为它们不会直接改变 DNA 序列，而是通过调控表观遗传状态来解析调控区域的功能。其中应用最广泛的抑制性融合结构是 KRAB，它可招募 KAP1 共抑制复合物，促进与基因沉默相关的组蛋白 H3 赖氨酸 9 三甲基化（H3K9me3）的沉积13。dCas9-KRAB 也被称为 CRISPR 干扰技术14，已被用于靶向并筛选单个增强子对基因表达的贡献15,16；然而，该技术尚未针对同时靶向多个区域进行优化。一种用于增强子的多重 CRISPR 干扰方法 Mosaic-seq17 采用单细胞 RNA 测序作为读出手段，但该技术成本较高，且由于单细胞 RNA 测序灵敏度较低，仅适用于高表达基因的研究。
我们旨在开发一种基于CRISPR干扰的技术，用于在雌激素转录应答背景下解析组合性增强子的功能。大约一半的雌激素响应基因在其附近含有两个或更多由雌激素受体α（ER）结合的增强子18，这表明多个增强子可能共同参与雌激素应答过程，而要理解其调控逻辑，则需要同时靶向多个增强子。由于早期在启动子区域使用CRISPR干扰的研究表明，并非所有启动子对KRAB介导的抑制均表现出同等程度的响应19，我们推测将一个不同的抑制结构域连接到dCas9上，可能有助于失活多种类型的增强子。我们选择了Mad1的Sin3a相互作用结构域（SID）20，因为它能够招募组蛋白去乙酰化酶21，从而去除与转录活性相关的组蛋白乙酰基团。重要的是，SID结构域在与dCas922和TALEs23融合时已被证明可有效降低基因表达，且Sin3a在多种增强子序列环境中均被证实是一种强效的抑制性共因子24。我们利用SID4x-dCas9-KRAB（Enhancer-i）靶向了10个不同的ER结合增强子，鉴定了在4个基因上对雌激素转录应答所必需的ER结合位点（ERBS）18。此外，我们还靶向了增强子的组合，以鉴定在驱动雌激素转录应答中协同作用的位点。我们发现，最多可同时靶向约50个位点，并检测到可观察的基因表达变化。通过ChIP-seq和RNA-seq分析，我们证明Enhancer-i是一种高度特异性的技术，可用于同时研究多个增强子。
在本实验方案中，我们描述了执行Enhancer-i的各个步骤。Enhancer-i是一种灵活的技术，可在组织培养条件下同时对多个增强子进行功能研究。Enhancer-i的结果与基因敲除高度一致，但其作用为依赖组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的瞬时失活。本方案通过瞬时转染递送向导RNA，而非通过病毒载体实现稳定整合，从而避免了H3K9me3的沉积及其可能的扩散。本方案详细说明了通过Gibson组装进行向导RNA设计与克隆、利用脂质体转染法转染向导RNA，以及通过qPCR分析基因表达变化的方法。我们还提供了在基因组和转录组水平上评估Enhancer-i靶向特异性的相关方法。尽管该技术最初是为研究人癌细胞系中由雌激素受体（ER）结合的增强子对基因调控的作用而开发，但其同样适用于解析任何哺乳动物增强子的功能。

<table><tbody><tr><td>ZR 96孔快速RNA试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green RNA-to-CT 一步法</td><td>应用生物系统公司</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>AflII 限制性内切酶</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion 高保真 PCR 预混液（含 HF 缓冲液）</td><td>NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 组装预混液</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA 纯化 &amp;amp; 浓缩试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>β-雌二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>人：Ishikawa 细胞</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac 兔多克隆抗体</td><td>Active Motif&amp;nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 兔多克隆抗体</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>FLAG小鼠单克隆抗体</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ERα 兔多克隆抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro 质粒</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>51133</td><td>沈 et al.，2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector 质粒</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali 等，2013</td></tr><tr><td>AflII U6 嘌呤霉素质粒</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton 等，2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB 质粒</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton 等，2017</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Stranded mRNA-Seq 试剂盒，含 KAPA mRNA 捕获磁珠</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 蛋白酶与磷酸酶抑制剂迷你片剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素选择性抗生素（G418硫酸盐）（50 mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

利用细胞系中基于多重crispr的增强子干扰解析增强子功能

Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

多个增强子通常共同调控同一个基因，但对于大多数基因而言，目前仍不清楚哪些增强子对基因表达是必需的，以及这些增强子如何协同作用以产生转录响应。由于已鉴定出数百万个增强子，因此需要高通量工具在全基因组范围内确定增强子的功能。目前研究增强子功能的方法包括利用具有核酸酶活性的Cas9进行基因删除，但该技术难以研究多个增强子的组合效应，因为必须依次构建多个克隆细胞系。本文介绍Enhancer-i，一种基于CRISPR干扰的技术，可在内源位点同时对多个增强子进行功能分析。Enhancer-i利用两个抑制结构域——SID和KRAB，与无核酸酶活性的Cas9融合，通过在靶向位点诱导组蛋白去乙酰化实现增强子失活。本实验方案采用向导RNA的瞬时转染，以实现靶区域的瞬时失活，特别适用于在组织培养条件下阻断可诱导的转录响应。Enhancer-i在基因组靶向和全局基因表达影响方面均具有高度特异性。通过本方案获得的结果有助于理解某个增强子是否参与基因表达、其贡献程度如何，以及这种贡献如何受到邻近其他增强子的影响。

图1展示了本实验方案中所述工作流程的示意图。为了确定靠近雌激素调控基因MMP17的内质网结合增强子的功能（根据ChIP-seq结果，该基因附近存在3个结合位点，见图2A），针对每个区域设计了向导RNA。向导RNA的设计方法如下：选取每个ER结合位点周围600–900 bp的序列区域，输入向导RNA设计程序。将预测脱靶位点数量为0–2的候选向导RNA序列通过BLAT比对至人类基因组。最终选择4个不重叠且覆盖ChIP-seq和DNaseI超敏感位点所定义区域的向导RNA用于靶向（图2B）。在每条向导RNA两端添加额外序列（表1），以便后续克隆操作，合成长度为59个核苷酸的片段。收到合成片段后，按位点稀释并混合，随后进行短片段PCR扩增，以在Gibson组装前添加同源序列。 图2C展示了使用“U6_internal”引物（表1）进行短片段PCR后预期得到的向导RNA产物：该反应将在59 bp的向导RNA片段两端各添加20个碱基对，最终获得约100 bp的序列。完成Gibson组装后，将这些向导RNA混合物转化至细菌中，并于次日提取质粒小量制备物。 图2D展示了一项增强子功能解析实验的结果，该实验利用Enhancer-i单独或联合靶向MMP17附近的多个增强子区域。Enhancer-i靶向的位点以黑色六边形标示。针对指定靶位点的向导RNA质粒被转染至稳定表达SID4X-dCas9-KRAB的雌激素剥夺Ishikawa细胞系中。两天后更换培养基，并加入嘌呤霉素以富集转染成功的细胞。次日，对细胞进行10 nM雌二醇处理8小时后收集细胞。提取RNA后进行一步法qPCR检测。本示例结果显示，在MMP17的完全雌激素应答中，位点1和位点2是必需的，而位点3在此条件下无显著贡献（图2D，泳道ii–iv）。当仅有位点2或位点3处于活性状态时（vi和vii），其雌激素应答水平与无任何位点激活时（viii）相似，表明这两个位点无法独立发挥作用。位点1自身可介导部分基因表达（v），但当位点1与位点2共同激活时，观察到最高的转录活性（iv）。
同时操控靠近4个不同基因的10个增强子图 3A），生成了包含42条增强子向导RNA和16条启动子向导RNA的复杂向导RNA文库。在初始向导RNA延伸PCR（步骤3.3）之前，将向导RNA寡核苷酸混合，所得PCR产物经纯化后，通过Gibson组装方法与空的嘌呤霉素U6克隆载体连接。Gibson组装完成后，进行多次独立转化并涂布平板。将平板上的菌落刮入LB培养基，培养2–4小时后进行质粒大提。 图3B 显示当这些引导RNA池被转染到稳定表达SID4X-dCas9-KRAB的雌激素剥夺Ishikawa细胞系中，并按上述方法处理后，通过qPCR检测到的基因表达代表性下调图 2D）。从增强子-i获得的降低效果与靶向假定目标基因启动子所获得的效果相似。 图3C 展示了使用Enhancer-i时，向导RNA稀释对降低雌激素反应的影响。对靠近增强子的向导RNA文库进行1:50稀释 G0S2 仍能显著降低基因表达，表明Enhancer-i可同时靶向多达50个位点。然而，失活效应会逐渐被稀释，说明除非采用更灵敏的检测方法，否则无法同时靶向数百个位点。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg" /> 
图1. 使用Enhancer-i进行多重增强子解析的实验流程示意图。 使用e-crisp设计向导RNA（红色和蓝色），并通过UCSC基因组浏览器进行筛选。选择四个覆盖目标区域（由ChIP-seq定义的转录因子结合位点）的向导RNA。针对每个目标区域（红色和蓝色）混合的向导RNA寡核苷酸通过PCR添加同源区域（橙色），随后进行Gibson组装和转化。将获得的质粒混合物通过脂质体转染法转染至稳定表达SID4X-dCas9-KRAB的细胞系，或与SID4X-dCas9-KRAB质粒共同转染至野生型细胞中。向导RNA质粒混合物可单独转染以逐个靶向特定位点，也可联合转染以同时靶向多个位点。转染后使用抗生素处理细胞，以富集含有向导RNA的细胞。转染约72小时后收集细胞。可提取核酸用于qPCR、RNA-seq或ChIP-seq分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg" /> 
图2. 引导RNA设计与增强子解析 MMP17. （A） 基因组浏览器截图显示靠近目标区域的ERα结合增强子（灰色） MMP17 此图经 Carleton 修改。 等18. (B) 3 个结合位点的向导 RNA 设计18ER 的结合位点由 ChIP-seq 定义，作为靶标，4 条向导 RNA 覆盖该区域。跨越结合位点的 DNaseI 敏感性信号也可用于确定向导 RNA 设计的靶序列。ChIP-seq 和 DNaseI HS 数据均来自经 10 nM 雌二醇处理 1 小时的 Ishikawa 细胞。 （C） 代表性向导RNA序列，已通过短片段PCR添加同源区域，可直接用于Gibson组装。 (D) 相对表达量 MMP17 通过 Enhancer-i 靶向特定区域并经 8 小时 10 nM 雌二醇处理后，利用 qPCR 测定。表达量相对于 CTCF 表达水平 MMP17 在未用雌二醇处理的细胞中。对照向导RNA靶向启动子的 IL1RN 所有误差线均表示标准误（SEM），双星号表示 p &#60;0.01 和单个星号表示 p &#60;0.05，在配对 t 检验中。此图经 Carleton 修改。 等.18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg" /> 
图3. 利用混合型增强子-i同时靶向不同基因附近的多个增强子 （A） 增强子-i 混合筛选中拟靶向的结合位点与启动子示意图 (B) E2处理后，转染Enhancer-i质粒池（绿色）、Promoter-i质粒池（蓝色）或对照gRNA（白色）的Ishikawa细胞中基因表达水平的qPCR检测结果18. 在使用 Enhancer-i 时，所有基因均观察到显著降低。该图改编自 Carleton， 等.18. (C) 对...的影响 G0S2 E2处理后，转染不同量靶向gRNA的Ishikawa细胞中的表达水平 G0S2即使使用少量的向导RNA（1:50稀释），仍可观察到显著降低，表明可同时靶向多达50个位点。所有误差线均表示标准误（SEM），双星号表示 p &#60;0.01 和单个星号表示 p &#60;0.05，在配对 t 检验中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>序列</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_internal_R&#160;</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 用于向导RNA扩增和测序、qPCR以及融合蛋白检测的引物。

本方案描述了使用失活融合蛋白SID4X-dCas9-KRAB（也称为增强子干扰，Enhancer-i）对增强子进行多重靶向设计与操作的步骤。该方案可用于鉴定调控基因表达的增强子，并有助于解析调控同一靶基因的多个增强子之间的相互关系。

利用细胞系中基于多重CRISPR的增强子干扰解析增强子功能

多个增强子通常调控同一个基因，但对于大多数基因而言，目前仍不清楚哪些增强子对基因表达是必需的，以及这些增强子如何协同发挥作用……

该方法有助于回答基因组学和基因调控领域的关键问题，例如多个基因调控区域（也称为增强子）如何协同作用以控制转录。该技术的主要优势在于，可同时检测多个不同基因附近的多个增强子，从而快速鉴定出参与基因调控的区域。开始设计向导RNA时，首先按照文本方案中所述生成DNA序列。使用 E-CRISP 等程序分析生成的 DNA 序列，以寻找脱靶效应较低的向导 RNA。向导 RNA 由位于原间隔序列邻近基序（PAM）上游的 20 个核苷酸组成，对于来自 S.pyogenes 的 dCas9，该基序的形式为 NGG。在 E-CRISP 网站上，使用下拉菜单选择目标生物体。基因组组装结果显示在物种名称的右侧。选择“输入为FASTA序列”单选按钮。将上方的FASTA序列复制并粘贴到对话框中。确保每个序列均包含 FASTA 标题。在下拉菜单中选择中等（medium）单选按钮和单设计（Single design）。单击按钮“开始单 gRNA 搜索”。一个新的浏览器标签页将会打开并显示结果。点击“下载所有查询序列的 Excel 格式化表格报告”按钮，下载候选序列。接下来，使用 UCSC 基因组浏览器通过 BLAT 将候选的全长向导 RNA 序列比对到基因组上。在浏览器中，访问 UCSC 基因组浏览器网站。在“我们的工具”部分，找到单词 BLAT 并点击它。BLAT 搜索工具将打开。使用位于 BLAT 搜索基因组文本下方的下拉菜单，选择目标生物体和基因组组装版本。从 E-CRISP 生成的表格报告中复制引导 RNA 序列，并将其粘贴到对话框中。确保每条序列具有唯一的 FASTA 标题，然后点击对话框底部的提交按钮。在BLAT搜索结果页面上，每条向导RNA序列的比对结果将逐行显示，每行代表一次比对。理想情况下，每条向导RNA应仅有一条比对结果，表明该向导RNA具有唯一性。应尽可能避免选择在基因组中映射到多个位置的向导RNA。为了检测向导 RNA 在目标区域内的定位与分布情况，请点击所查询的某条向导 RNA 对应的“操作”部分中的浏览器链接。基因组浏览器将出现，并以选定的向导 RNA 为中心。使用页面顶部的缩小按钮，以查看 E-CRISP 在目标区域内鉴定出的其他向导 RNA 的分布情况。选择四个尽可能不重叠的向导RNA，均匀分布在目标区域中。如果目标区域超过600个碱基对，可考虑增加一到两个向导RNA。避免选择含有同聚物序列或GC含量极端的向导RNA，因为这些特征可能阻碍向导RNA的克隆过程并降低其靶向效率。将向导 RNA 寡核苷酸用超纯水重悬，配制成终浓度为 100 微摩尔的溶液。每个目标区域应至少包含四个独立的向导 RNA 寡核苷酸。针对每个感兴趣的调控区域，将对应于该区域的所有寡核苷酸混合，制备成寡核苷酸混合液。在微量离心管中，为每个区域分别加入五微升（µL）各自重建的向导RNA寡核苷酸。通过涡旋充分混匀混合物，然后取出一微升（µL），用超纯水将其精确稀释至1比200。按照文本方案中的说明，使用USICS引物进行短片段PCR，以将同源区域连接至寡核苷酸上。每个寡核苷酸将添加约40个碱基，产生一个约100个碱基对的产物，其两端均含有与USIC光谱两端足够的同源性。接下来，在冰上设置Gibson组装反应。在20微升反应体系中使用50纳克的消化载体和7纳克的插入片段。同时，使用50纳克的载体设置仅含消化后载体的Gibson组装反应，并用水替代插入片段。将Gibson组装反应在50摄氏度孵育15分钟，随后置于4摄氏度保存。将组装产物转移至冰上后，在冰上用超纯水按1比4稀释。例如，将五微升（5 µL）Gibson Assembly 产物加入到十五微升（15 µL）超纯水中。接着转化稀释后的 Gibson Assembly 产物。将高效感受态细胞置于冰上，每轮转化取 25 微升（25 µL）等分试样。如果需要构建针对多个位点的复杂文库，请将足够数量的细胞分装到不同的离心管中，以进行多次独立的转化实验。取50微升转化后的细胞涂布平板，并将平板置于37摄氏度培养箱中过夜培养。对于针对单个位点的文库进行小量质粒提取时，可将细胞直接接种于3至5毫升含有氨苄青霉素或羧苄青霉素的LB液体培养基中。在37摄氏度、250 rpm振荡条件下，将细胞过夜培养。对于大规模文库，使用细胞刮刀将每个单独培养皿上的所有菌落收集到一个大提中。可通过向15毫升Falcon管中加入约5毫升含适当抗生素的LB培养基，并将菌落刮入该管中以方便操作。转染前一天，将细胞以30%至50%的融合度接种于24孔板中。接种足够数量的细胞，以便每个转染实验均能设置重复孔，并设置转染对照向导RNA的孔。细胞接种后，轻轻摇动培养板，确保细胞在孔内均匀分布。前15分钟内每5分钟摇动一次。次日，按照所选转染试剂的说明书进行转染操作。对于Ishikawa细胞，每24孔板每孔使用550纳克总质粒。将质粒用无血清培养基稀释至终浓度为0.20微克/毫升。每1微克DNA使用3微升转染试剂，轻轻涡旋混匀，并在室温下孵育5至10分钟。向每孔中加入25微升最终混合液。配制含有1%β-巯基乙醇的裂解缓冲液，确保体积充足。使用真空抽吸装置吸除培养基。用等体积的1× PBS洗涤细胞一次，并抽吸尽可能去除PBS。使用多通道移液器向每个孔中加入 300 微升裂解 BME 溶液。将裂解液上下吹打 8 至 10 次，转移至深孔板或置于冰上的 1.7 毫升 Eppendorf 离心管中。RNA 可立即提取，或在 -80 °C 冻存裂解物以备后续处理。显示了针对 MMP17 附近三个转录因子结合位点的向导 RNA 设计。目标区域为通过 ChiP-seq 定义的 ER alpha 结合位点，四个向导 RNA 覆盖该区域。此处展示的是使用 USIC 内部引物进行短片段 PCR 后预期的向导 RNA 产物。该反应将在59个碱基对的向导RNA片段两端各添加20个碱基对的序列，最终得到一段约100个碱基对的序列。图中显示了在MMP17位点进行Enhancer-I实验的定性PCR结果。Enhancer-I所靶向的位点以黑色六边形标示。位点1和位点2对于MMP17的完全雌激素反应是必需的，而位点3无贡献。位点1自身可介导部分表达，但当位点1和位点2同时激活时，活性最高。一旦针对目标细胞系优化完成，若操作得当，该技术可在5至7天内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何为Enhancer-I设计向导RNA，如何构建并转染复杂的向导RNA文库，以及如何收集转染后的细胞。在进行该实验操作时，维持无菌的细胞培养环境，并使用无RNase和无DNase的实验材料至关重要。在完成本实验流程后，还可结合其他方法（如ChIP-seq和RNA-seq）进一步回答更多科学问题，例如Enhancer-I在基因组中的结合位点，以及其对全局基因表达的影响方式。该技术问世后，为研究人员探索雌激素在人类基因组内源性位点诱导的基因调控提供了途径，从而不再依赖附加体报告基因系统。请务必注意，在哺乳动物细胞培养环境中操作可能存在危险，因此进行该实验时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

基于多重 CRISPR 增强器的细胞系干扰增强功能解剖

CRISPR/Cas9 是一种强大的系统，可用于破坏基因和遗传元件。本文介绍了一种利用 CRISPR/Cas9...

利用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中产生基因组缺失

基因组编辑工具（如CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas（CRISPR相关蛋白）系统）显著提高了在人诱导性多能干细胞（hiPSCs）中进行基因靶向的效率。本文描述了一种利用CRISPR/Cas系统介导的同源重组技术，构建谱系特异性hiPSC报告细胞系的实验方案。...

利用CRISPR/Cas9与Cas9双切口酶系统高效构建hiPSC神经谱系特异性敲入报告细胞系

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus...

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

本文描述了利用iCRISPR平台生成人多能干细胞（hPSC）突变细胞系以及将hPSC分化为葡萄糖响应性β样细胞的实验方案。将基因组编辑技术与hPSC定向分化相结合，为系统分析谱系决定因子在人类发育和疾病进展中的作用提供了强有力的平台。...

利用基因组编辑和hPSC定向分化探究人类胰腺发育中的谱系决定因子

CRISPR-Cas 是一种用于编辑动植物复杂基因组的强大技术。本文详细介绍了一种利用不同 Cas...

使用CRISPR-Cas在哺乳动物细胞系中进行基因组编辑

直接递送预先组装的Cas9/向导RNA核糖核蛋白复合物是实现造血细胞基因组编辑的一种快速高效的方法。在此，我们利用该方法删除RUNX1基因内含子中的沉默子，并检测OCI-AML3白血病细胞中的转录应答。...

利用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在急性髓系白血病细胞中研究 RUNX1 内含子沉默子的转录调控作用

我们报道了在由胚胎干细胞生成的拟胚体中应用定量染色体构象捕获技术并结合高通量测序的方法。该技术可用于鉴定和定量分析在胚胎干细胞分化过程中特定基因的潜在增强子与启动子区域之间的相互作用。...

通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

本方案描述了一种高通量的成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）基因编辑工作流程，用于微小RNA（miRNA）簇网络分析，可在单次实验中快速构建一系列基因修饰的细胞系，这些细胞系携带不同miRNA簇成员的特异性缺失组合，缺失片段长度可达35...

用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

本方案描述了利用质粒DNA转染和mRNA核转染技术，在人源细胞系中进行基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）的表观基因组编辑的方法。...

利用质粒DNA转染和mRNA核转染递送在人类细胞中进行CRISPR表观基因组编辑

本方案提供了一条简化的计算流程，用于定量新生增强子转录本。通过整合染色质可及性、染色质特征和转录数据，该方法能够在复杂的基因内区域实现对增强子活性的准确检测和链特异性分析，同时适用于不具备深入生物信息学训练背景的研究人员。...

小鼠胚胎干细胞中基因间/基因内增强子RNA定量的计算分析流程

学习使用SID4X-dCas9-KRAB融合蛋白进行多重增强子靶向干扰的方法，通过E-CRISP设计向导RNA并在Ishikawa细胞中实现基因表达调控。该技术可快速鉴定调控特定基因的增强子区域，为基因组学和基因调控研究提供高效工具。

利用细胞系中基于多重CRISPR的增强子干扰解析增强子功能

探索更多视频