利用细胞系中基于多重CRISPR的增强子干扰解析增强子功能

该方法有助于回答基因组学和基因调控领域的关键问题，例如多个基因调控区域（也称为增强子）如何协同作用以控制转录。该技术的主要优势在于，可同时检测多个不同基因附近的多个增强子，从而快速鉴定出参与基因调控的区域。开始设计向导RNA时，首先按照文本方案中所述生成DNA序列。

使用 E-CRISP 等程序分析生成的 DNA 序列，以寻找脱靶效应较低的向导 RNA。向导 RNA 由位于原间隔序列邻近基序（PAM）上游的 20 个核苷酸组成，对于来自 S.pyogenes 的 dCas9，该基序的形式为 NGG。在 E-CRISP 网站上，使用下拉菜单选择目标生物体。

基因组组装结果显示在物种名称的右侧。选择“输入为FASTA序列”单选按钮。将上方的FASTA序列复制并粘贴到对话框中。

确保每个序列均包含 FASTA 标题。在下拉菜单中选择中等（medium）单选按钮和单设计（Single design）。单击按钮“开始单 gRNA 搜索”。

一个新的浏览器标签页将会打开并显示结果。点击“下载所有查询序列的 Excel 格式化表格报告”按钮，下载候选序列。接下来，使用 UCSC 基因组浏览器通过 BLAT 将候选的全长向导 RNA 序列比对到基因组上。

在浏览器中，访问 UCSC 基因组浏览器网站。在“我们的工具”部分，找到单词 BLAT 并点击它。BLAT 搜索工具将打开。

使用位于 BLAT 搜索基因组文本下方的下拉菜单，选择目标生物体和基因组组装版本。从 E-CRISP 生成的表格报告中复制引导 RNA 序列，并将其粘贴到对话框中。确保每条序列具有唯一的 FASTA 标题，然后点击对话框底部的提交按钮。

在BLAT搜索结果页面上，每条向导RNA序列的比对结果将逐行显示，每行代表一次比对。理想情况下，每条向导RNA应仅有一条比对结果，表明该向导RNA具有唯一性。应尽可能避免选择在基因组中映射到多个位置的向导RNA。

为了检测向导 RNA 在目标区域内的定位与分布情况，请点击所查询的某条向导 RNA 对应的“操作”部分中的浏览器链接。基因组浏览器将出现，并以选定的向导 RNA 为中心。使用页面顶部的缩小按钮，以查看 E-CRISP 在目标区域内鉴定出的其他向导 RNA 的分布情况。

选择四个尽可能不重叠的向导RNA，均匀分布在目标区域中。如果目标区域超过600个碱基对，可考虑增加一到两个向导RNA。避免选择含有同聚物序列或GC含量极端的向导RNA，因为这些特征可能阻碍向导RNA的克隆过程并降低其靶向效率。

将向导 RNA 寡核苷酸用超纯水重悬，配制成终浓度为 100 微摩尔的溶液。每个目标区域应至少包含四个独立的向导 RNA 寡核苷酸。针对每个感兴趣的调控区域，将对应于该区域的所有寡核苷酸混合，制备成寡核苷酸混合液。

在微量离心管中，为每个区域分别加入五微升（µL）各自重建的向导RNA寡核苷酸。通过涡旋充分混匀混合物，然后取出一微升（µL），用超纯水将其精确稀释至1比200。按照文本方案中的说明，使用USICS引物进行短片段PCR，以将同源区域连接至寡核苷酸上。

每个寡核苷酸将添加约40个碱基，产生一个约100个碱基对的产物，其两端均含有与USIC光谱两端足够的同源性。接下来，在冰上设置Gibson组装反应。在20微升反应体系中使用50纳克的消化载体和7纳克的插入片段。

同时，使用50纳克的载体设置仅含消化后载体的Gibson组装反应，并用水替代插入片段。将Gibson组装反应在50摄氏度孵育15分钟，随后置于4摄氏度保存。将组装产物转移至冰上后，在冰上用超纯水按1比4稀释。

例如，将五微升（5 µL）Gibson Assembly 产物加入到十五微升（15 µL）超纯水中。接着转化稀释后的 Gibson Assembly 产物。将高效感受态细胞置于冰上，每轮转化取 25 微升（25 µL）等分试样。

如果需要构建针对多个位点的复杂文库，请将足够数量的细胞分装到不同的离心管中，以进行多次独立的转化实验。取50微升转化后的细胞涂布平板，并将平板置于37摄氏度培养箱中过夜培养。对于针对单个位点的文库进行小量质粒提取时，可将细胞直接接种于3至5毫升含有氨苄青霉素或羧苄青霉素的LB液体培养基中。

在37摄氏度、250 rpm振荡条件下，将细胞过夜培养。对于大规模文库，使用细胞刮刀将每个单独培养皿上的所有菌落收集到一个大提中。可通过向15毫升Falcon管中加入约5毫升含适当抗生素的LB培养基，并将菌落刮入该管中以方便操作。

转染前一天，将细胞以30%至50%的融合度接种于24孔板中。接种足够数量的细胞，以便每个转染实验均能设置重复孔，并设置转染对照向导RNA的孔。细胞接种后，轻轻摇动培养板，确保细胞在孔内均匀分布。

前15分钟内每5分钟摇动一次。次日，按照所选转染试剂的说明书进行转染操作。对于Ishikawa细胞，每24孔板每孔使用550纳克总质粒。

将质粒用无血清培养基稀释至终浓度为0.20微克/毫升。每1微克DNA使用3微升转染试剂，轻轻涡旋混匀，并在室温下孵育5至10分钟。向每孔中加入25微升最终混合液。

配制含有1%β-巯基乙醇的裂解缓冲液，确保体积充足。使用真空抽吸装置吸除培养基。用等体积的1× PBS洗涤细胞一次，并抽吸尽可能去除PBS。

使用多通道移液器向每个孔中加入 300 微升裂解 BME 溶液。将裂解液上下吹打 8 至 10 次，转移至深孔板或置于冰上的 1.7 毫升 Eppendorf 离心管中。RNA 可立即提取，或在 -80 °C 冻存裂解物以备后续处理。

显示了针对 MMP17 附近三个转录因子结合位点的向导 RNA 设计。目标区域为通过 ChiP-seq 定义的 ER alpha 结合位点，四个向导 RNA 覆盖该区域。此处展示的是使用 USIC 内部引物进行短片段 PCR 后预期的向导 RNA 产物。

该反应将在59个碱基对的向导RNA片段两端各添加20个碱基对的序列，最终得到一段约100个碱基对的序列。图中显示了在MMP17位点进行Enhancer-I实验的定性PCR结果。Enhancer-I所靶向的位点以黑色六边形标示。

位点1和位点2对于MMP17的完全雌激素反应是必需的，而位点3无贡献。位点1自身可介导部分表达，但当位点1和位点2同时激活时，活性最高。一旦针对目标细胞系优化完成，若操作得当，该技术可在5至7天内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何为Enhancer-I设计向导RNA，如何构建并转染复杂的向导RNA文库，以及如何收集转染后的细胞。在进行该实验操作时，维持无菌的细胞培养环境，并使用无RNase和无DNase的实验材料至关重要。在完成本实验流程后，还可结合其他方法（如ChIP-seq和RNA-seq）进一步回答更多科学问题，例如Enhancer-I在基因组中的结合位点，以及其对全局基因表达的影响方式。

该技术问世后，为研究人员探索雌激素在人类基因组内源性位点诱导的基因调控提供了途径，从而不再依赖附加体报告基因系统。请务必注意，在哺乳动物细胞培养环境中操作可能存在危险，因此进行该实验时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护装备。