基于多重 CRISPR 增强器的细胞系干扰增强功能解剖
June 2nd, 2018
本协议描述了设计和执行多路化增强剂的步骤, 该方法与停用融合蛋白 SID4X-dCas9-KRAB (即增强器干扰) 相结合。该协议能够识别出调节基因表达的增强剂, 并促进调节共同靶基因的促促剂之间的关系的解剖。
这种方法可以帮助回答基因组学和基因调控领域的关键问题，例如多个基因调控区域（也称为增强子）如何协同工作以控制转录。该技术的主要优点是可以同时测试多个不同基因附近的多个增强子，以便快速识别参与基因调控的区域。要开始指导 RNA 设计，首先按照文本方案中的说明生成 DNA 序列。
在生成的 DNA 序列上使用 E-CRISP 等程序来查找低脱靶的向导 RNA。向导 RNA 由前间隔区相邻基序上游的 20 个核苷酸组成，该基序以化脓性链球菌 dCas9 的 NGG 形式出现。在 E-CRISP 网站上，使用下拉菜单选择感兴趣的生物体。
基因组组装显示在物种名称的右侧。选择 Input is FASTA sequence 单选按钮。从上面复制 FASTA 序列并将其粘贴到对话框中。
确保每个序列都包含 FASTA 标头。选择 medium 单选按钮和 Single design 在下拉菜单中。单击按钮 Start single gRNA search（开始单个 gRNA 搜索）。
将打开一个新的浏览器选项卡并显示结果。通过单击按钮下载候选序列， Download an Excel formulated tabular report for all query sequences together.接下来，使用 UCSC 基因组浏览器将候选全长向导 RNA 序列BLAT 到基因组。
在浏览器中，导航到 UCSC 基因组浏览器网站。在"我们的工具"部分下，找到单词 BLAT 并单击它。BLAT 搜索工具将打开。
使用 BLAT 搜索基因组文本下的下拉菜单选择感兴趣的生物体和基因组组装。从 E-CRISP 生成的表格报告中复制向导 RNA 序列并将其粘贴到对话框中。确保每个序列都有唯一的 FASTA 标头，然后单击对话框底部的 submit。
在 BLAT 搜索结果页面上，将出现每个向导 RNA 序列的比对，每行代表一个比对。理想情况下，每个向导 RNA 应该有一个比对，表明该向导 RNA 的唯一性。如果可能，请避免映射到基因组中多个位置的向导。
要检查目标区域内的向导 RNA 定位和分布，请单击查询到的向导 RNA 之一的 Actions 部分下的浏览器链接。将出现基因组浏览器，并将以选定的向导 RNA 为中心。使用页面顶部的缩小按钮，可视化 E-CRISP 鉴定的其他向导 RNA 在目标区域内的分布。
选择四种（最好是非重叠的）向导 RNA，它们分布在整个目标区域。如果感兴趣区域超过 600 个碱基对，请考虑添加一到两个额外的指南。避免使用具有均聚物延伸和极端 GC 含量的向导 RNA，因为这些特性会阻碍向导 RNA 克隆过程并降低向导 RNA 靶向效率。
在超纯水中以终浓度为 100 μmol 的比例重构向导 RNA 寡核苷酸。每个目标区域至少应有四个单独的向导 RNA 寡核苷酸。对于每个感兴趣的调节区域，创建一个包含与目标区域对应的所有寡核苷酸的池。
在 Eppendorf 管中，为每个区域混合 5 μL 每种单独的重组向导 RNA 寡核苷酸。涡旋将池充分混合，然后取出 1 微升，并在超纯水中将此 Eloquat 稀释 1 至 200。使用 USICS 引物进行短 PCR，以将同源区域连接到寡核苷酸上，如文本方案中所述。
每个寡核苷酸中将添加大约 40 个碱基，产生大约 100 个碱基对产物，其两端与 USIC 光谱具有足够的同源性。接下来，在冰上设置 Gibson Assembly 反应。在 20 μL 反应中使用 50 ng 消化的载体和 7 ng 的插入片段。
此外，使用 50 ng 载体构建仅消化载体的 Gibson Assembly 反应，并用水替换插入片段。将 Gibson Assembly 反应物在 50 摄氏度下孵育 15 分钟，然后在 4 摄氏度下保持。将组装的产品转移到冰中后，在冰上用超纯水将它们稀释 1 到 4 次。
例如，将 5 微升 Gibson Assembly 产品添加到 15 微升超纯水中。接下来，转化稀释的 Gibson Assembly 产品。将高效感受态细胞落在冰上，每次转化制备 25 μL eloquats。
如果需要针对多个位点的复杂池，请将足够的细胞放入不同的试管中以执行多个独立转化。将 50 微升转化的细胞铺板，并将板置于 37 摄氏度的培养箱中过夜。对于针对单个位点的池的小量制备，将细胞直接置于 3 至 5 mL 含有氨苄青霉素或羧苄青霉素的 LB 肉汤中。
将细胞以 250 rpm 和 37 摄氏度振荡孵育过夜。对于大型文库，使用板刮刀将每个板中的所有克隆收集到一次 maxi prep 中。这可以通过将大约 5 毫升 LB 和适当的抗生素倒入 15 毫升 Falcon 管中，然后将菌落刮入管中来实现。
转染前一天，将细胞接种在 24 孔板中，汇合度为 30% 至 50%。对足够的细胞进行铺板，以便可以一式两份进行转染，并包括要用对照向导 RNA 转染的孔。在细胞铺板后轻轻摇动板，确保细胞均匀分布在孔中。
在前 15 分钟内每 5 分钟摇晃一次。第二天，根据所选转染试剂的说明制备转染。对于 Ishikawa 细胞，对于 24 孔板的每个孔使用 550 ng 总质粒。
在无血清培养基中将质粒稀释至终浓度为 020 μg/mL。每 1 μg DNA 使用 3 μL 转染试剂，轻轻涡旋，并在室温下孵育 5 至 10 分钟。向每个孔中加入 25 微升最终混合物。
用 1% β-巯基乙醇制备足够体积的裂解缓冲液。使用真空吸液器吸出介质。用等体积的 1x PBS 洗涤细胞一次，然后吸出以去除尽可能多的 PBS。
使用多通道移液器向每个孔中加入 300 微升裂解 BME 溶液。将裂解溶液上下移液 8 到 10 次，然后转移到深孔板或冰上的 1.7 ml Eppendorf 管中。可以立即提取 RNA，也可以将裂解物冷冻在零下 80 摄氏度以备将来处理。
显示了 MMP17 附近 3 个转录因子结合位点的向导 RNA 设计。靶区域是 ChiP-seq 定义的 ER α 的结合位点，四个向导 RNA 平铺在该区域。这里显示的是使用 USIC 内部引物进行短暂 PCR 后的预期向导 RNA 产物。
该反应将在 59 个碱基对向导 RNA 片段的每一端添加 20 个碱基对序列，从而得到大约 100 个碱基对序列。显示了 MMP17 的 Enhancer-I 实验的定性 PCR 结果。Enhancer-I 靶向的位点用黑色六边形表示。
位点 1 和 2 是 MMP17 完全雌激素反应所必需的，而位点 3 没有贡献。站点 1 本身可以提供一些表达式，但当站点 1 和 2 处于活动状态时，可以看到最大的活动。一旦针对目标细胞系进行了优化，如果作得当，该技术可以在 5 到 7 天内完成。
观看本视频后，您应该对如何为 Enhancer-I 设计向导 RNA、创建和转染向导 RNA 的复杂库以及收获转染细胞有很好的了解。在尝试此过程时，重要的是要保持无菌的组织培养环境，并使用不含 RNase 和 DNase 的材料。在此程序之后，可以使用其他方法（如 ChiP-seq 和 RNA-seq）来回答其他问题，例如 Enhancer-I 在基因组中的哪个位置结合，以及它如何影响整体基因表达。
开发后，这项技术为研究人员探索人类基因组内源性基因座的雌激素诱导基因调控铺平了道路，而不是使用游离型报告基因。不要忘记，在哺乳动物组织培养环境中工作可能很危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴个人防护设备。
概述
本协议概述了使用SID4X-dCas9-KRAB融合蛋白对增强子进行多重靶向的设计和执行，促进识别调控基因表达的增强子。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组学
- 基因调控
- 增强子靶向
背景
- 增强子是控制转录的关键调控区域。
- 理解增强子相互作用对阐明基因表达机制至关重要。
- 该方法允许同时测试多个增强子。
- 导向RNA设计是该协议的关键步骤。
研究目的
- 识别调控特定目标基因的增强子。
- 解析增强子与基因表达之间的关系。
- 提供多重增强子靶向的方法。
使用的方法
- 使用E-CRISP设计导向RNA，以获得低脱靶效应。
- 使用UCSC基因组浏览器对导向RNA进行比对和定位。
- 进行Gibson组装以构建质粒。
- 用含有导向RNA的质粒转染细胞。
主要结果
- 成功识别了参与基因调控的增强子区域。
- 展示了多重增强子靶向的能力。
- 提供了导向RNA设计和组装的简化协议。
- 促进了关于增强子-基因相互作用的进一步研究。
结论
- 该协议能够为基因调控研究提供高效的增强子靶向。
- 它增强了对复杂基因调控网络的理解。
- 未来的应用可能包括针对增强子的治疗干预。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding enhancer function is critical for target validation in drug discovery, as enhancers modulate disease-relevant gene expression. The Enhancer-i method enables rapid, multiplexed interrogation of regulatory elements, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery. This approach helps prioritize targets by clarifying which enhancers drive transcriptional responses in disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates enhancer contributions to gene expression, clarifying therapeutic hypothesis validity.
- Operational Value: Enables simultaneous testing of multiple enhancers, accelerating target de-risking.
- Predictive Value: Determines enhancer necessity and combinatorial effects, improving target confidence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of enhancer activity via transcriptional response measurement.
- Operational Value: Uses transient transfection for scalable, reproducible enhancer screening in cell lines.
- Assay Readiness: Produces standardized biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links enhancer function to disease-relevant gene regulation in human cell models.
- Mechanistic De-risking: Identifies non-contributing enhancers, reducing ambiguity in target modulation strategies.
- Preclinical Alignment: Supports biomarker-ready models by defining functional regulatory elements.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, enabling enhancer validation before assay development and screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-gene relationships and pathway clarification.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantifiable transcriptional outputs for compound testing.
- Analytics: Provides enhancer activity measurements that inform dose-response and target engagement studies.
- Translational Research: Connects enhancer modulation to phenotypic outcomes in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for enhancer screening across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by defining enhancer necessity and combinatorial logic.
- Operational Value: Offers standardized, transient enhancer modulation compatible with high-throughput workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on enhancer-driven expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in guide RNA design and CRISPR-based modulation techniques.
- Dependent on transfection efficiency and access to molecular cloning infrastructure (e.g., Gibson Assembly).
- Needs cross-team standardization for guide RNA validation and off-target assessment.
- Adaptable to various cell lines, though optimization may be needed for primary or hard-to-transfect systems.
- Limited to transcriptional readouts; requires integration with orthogonal assays for functional validation.
