批次式与连续式生物反应器

生物反应器也称为发酵罐，是为细胞培养提供适宜生长环境的细胞培养系统。在细胞培养中，常用的生物反应器主要有两种类型：分批式反应器和连续搅拌釜式反应器。分批式反应器是一种封闭的容器系统，包含细胞培养所需的所有组分；而连续搅拌釜式反应器则是一种开放系统，组分可主动流入和流出，从而实现废物的去除和营养物质的补充。为了最大限度地促进细胞生长并提高细胞密度，两种系统均可控制多个反应器参数，包括温度、压力、溶解氧和pH值。本视频将介绍分批式和连续式反应器的基本原理，并演示在实验室中使用这些反应器的具体操作步骤。

最简单的生物反应器类型是分批式反应器，它是一个封闭系统，内含细胞培养基和一定数量的细胞。随着细胞生长，它们消耗营养物质并排出代谢废物，这些废物会在反应器中逐渐积累。另一种常用的反应器是连续搅拌釜式反应器，属于开放系统，其中营养物质持续流入，细胞和细胞代谢废物则持续流出。这种方法可通过清除废物和补充营养物质来调控细胞密度。在使用上述任一系统之前，通常需用蒸汽对组件进行灭菌 ，以减少污染风险。当反应器完全组装后，将无菌培养基加入主反应容器，并接种初始培养物。在运行过程中，通过搅拌桨控制混合与供氧，以维持均匀的溶液环境，确保细胞获得足够的营养物质和氧气用于生长。此外，发酵罐系统通常配备探针，用于监测温度、溶解氧和pH等参数，以确保细胞生长处于最佳条件。在分批培养过程中，细胞群体经历典型的生长阶段：首先为延滞期，细胞适应环境，生长缓慢；随后进入对数期，细胞以指数速率分裂，直至营养物质耗尽或有毒副产物达到临界水平；最终生长速度减缓，细胞进入稳定期，此时可从培养物中收获目标产物。目标产物可能由细胞分泌并直接从培养液中收集，也可能保留在细胞内，需通过细胞裂解方式提取。收获完成后，反应器需经过清洗和灭菌处理，为下一批细胞培养做准备。

连续搅拌釜式反应器在初始阶段表现出类似的生长模式 ，并在稳态运行时达到恒定的细胞密度。然而，该细胞密度取决于稀释速率，即进料与出料速率除以反应器体积。因此，当稀释速率接近1时，细胞密度会下降。在考虑生物反应器构型时，需注意分批式反应器因其结构简单、成本较低而被广泛使用，但其细胞密度受限；连续式反应器则可提高细胞密度。然而，在高细胞密度下可能发生细胞聚集，从而影响最佳生长状态。此外，长时间的发酵过程可能增加培养物污染的风险。

在介绍了间歇式反应器和连续式反应器之后，让我们来考察这两种反应器的操作流程，首先从间歇式反应器开始。在使用间歇式反应器之前，需将细胞培养基加入一个洁净的反应容器中。容器装填完毕后，用去离子水冲洗各组件并进行组装。这些组件包括顶板、用于取样培养物的收获管、用于维持培养物均匀性和培养基氧合的搅拌桨，以及向培养物中通入气体的气体分布器。接下来安装溶氧探头，用于测量容器中溶解氧的含量，同时安装用于添加酸或碱以调节pH的进料管路，以及经过校准的pH探头。当所有组件安装完毕后，将组装好的反应器通过高压灭菌器进行灭菌。随后将容器安装到发酵罐底座上，并将pH探头和溶氧探头连接至计算机。此外，气体分布器连接至气体转子流量计，用于测量气体流速。此时启动搅拌桨，并调节气体流量、温度和容器搅拌速度，直至达到所需参数。接着用酒精对接种口进行灭菌，然后将种子培养物注入反应器容器中。在运行过程中，于选定的时间点采集细胞培养样品，根据细胞密度测量结果绘制生长曲线。当细胞密度达到预期水平时，停止培养，并通过一系列过滤步骤从容器中收获细胞。剩余的容器内容物则使用漂白剂或其他抗菌物质进行处理。

与分批式反应器类似，连续搅拌釜式反应器（有时称为恒化器）在组装前也需要将其各个部件用去离子水彻底冲洗。清洗完成后，将搅拌装置与驱动轴部件组装在一起，并向反应器容器中加入去离子水，以提高高压灭菌过程中的灭菌效果。随后对溶解氧、pH 和温度探头进行校准并安装。容器完全组装后，使用高压灭菌器对反应器进行灭菌。灭菌完成后，将容器置于加热套中以控制其温度，并连接已校准的探头。然后连接培养基大瓶和带有无菌滤器的空气供应系统，再开启气流。通过松开大瓶的管路夹，使无菌培养基流入系统，启动基础发酵程序。当培养基流入正在运行的反应器时，先用酒精对接种口进行消毒，然后向容器中加入1毫升的种子培养物。在运行过程中，于选定的时间点采集培养样品以测定细胞密度。这些数据可用于构建生长曲线。当培养物达到稳态（即细胞密度保持恒定）时，即实现最佳生长。

在了解了间歇式反应器和连续搅拌釜式反应器之后，让我们来看一下这项技术的一些实际应用。啤酒酿造通常在间歇式反应器系统中进行。将一组基本原料——包括纯化水、麦芽大麦、啤酒花和酵母——加入反应器中。麦芽大麦作为富含糖分的营养源，可促进酵母的发酵过程；酵母消耗糖分后，将酒精作为代谢废物产生。当混合物达到目标酒精浓度，或按规定的时长完成发酵后，即可进行过滤、包装，并静置陈化以实现碳酸化，最终产品便可投入市场。标准反应器也可根据特定用途进行定制。例如，可通过专用反应器实现持续搅拌，从而增强细胞与营养物质的分布，提高组织支架中的细胞存活率。同时，可对支架施加机械刺激，以促进细胞外基质的生成，并主动引导细胞的生长与分化。由此获得的支架具有更优的生理和力学性能，因而适用于植入应用。

您刚刚观看了 JoVE 关于间歇式反应器和连续搅拌反应器的视频。现在，您应该了解间歇式反应器和连续搅拌釜式生物反应器的工作原理，以及这些系统在生物工程领域的应用。感谢观看。