光学生物传感

光学生物传感器是一类利用光来检测特定生物靶标或目标物的传感器。这类设备已广泛应用于医疗健康、制药、环境监测、国土安全，甚至战场领域。光学生物传感器通常分为基于标记的传感器和无标记传感器两大类。基于标记的检测方法的一个实例是聚合酶链式反应（PCR），该方法使用荧光标记物（即荧光团）来定量扩增后的目标DNA。无标记检测方法的一个例子是表面等离子体共振（SPR）。在此技术中，通过测量传感器的基本特性（如反射角），对未修饰的生物分子与传感器表面的相互作用进行定量分析。本视频将回顾上述两类光学生物传感技术的基本原理、关键组件、工作原理以及光学生物传感器的常见应用。

首先，让我们了解基于标记的光学生物传感的一般原理。通常，使用传统的固定化化学方法，将探针或生物识别元件（如互补抗体）固定在传感器表面。然后使样品溶液流经传感器表面。来自复杂样品溶液中的目标分子（与固定的生物识别元件互补）被选择性地捕获。接着用缓冲液或水洗去多余的样品溶液。随后，为了帮助可视化并量化结合的目标分子量，将一种与目标分子互补且连接有荧光团的二抗分子引入系统中。经过一段时间，当二抗分子与目标分子结合后，再洗去未结合的过量荧光团。然后可使用荧光显微镜定量检测结合的荧光团的强度。首先，针对一系列已知浓度的目标分子绘制荧光强度，建立校准曲线，从而实现对未知量捕获目标分子的直接测定。因此，基于标记的技术利用高度敏感荧光团的荧光强度来定量目标生物分子的浓度。

在回顾了基于标记的光学生物传感器原理之后，让我们来看一个常用的实例——目前DNA扩增的标准方法：定量PCR（qPCR）。qPCR反应体系中包含一种带标记的探针，用于实时定量反应进程。该探针序列连接了荧光报告分子和淬灭分子，并可特异性结合目标DNA序列。当报告分子和淬灭分子均连接在探针上时，淬灭分子会抑制荧光基团的荧光发射。在PCR反应过程中，DNA聚合酶降解探针DNA，使荧光报告分子与淬灭分子在空间上分离，从而解除淬灭效应，导致荧光信号增强。进行qPCR时，首先将包括标记探针在内的所有反应组分加入PCR管或孔板中；随后，将PCR板放入专用的热循环仪中，并设置每个循环的参数及循环次数。用于qPCR的热循环仪配备有光源、必要的光学元件（用于选择特定波长）以及检测器，可在PCR反应过程中实时测量荧光强度。每个热循环结束时，系统记录因荧光基团释放而产生的荧光强度并绘制曲线。荧光强度与反应孔中目标分子浓度的对数成正比，因此，根据已知的荧光信号，可计算出未知样品中目标分子的浓度。

现在让我们探讨如何利用无标记光学传感技术，在不使用荧光染料等报告分子的情况下实现检测。对于无标记技术而言，生物识别元件的固定化过程与基于标记的技术相同。任何生物分子与这些传感器表面的结合都会改变光学器件近表面区域的折射率。目标分子与功能化光学器件表面结合，形成一层薄层，进一步改变折射率。这些折射率的变化可通过监测系统固有振动频率或共振频率的变化来进行追踪。目标分子结合前后共振频率的差异，即所谓的 f 偏移（f shift），与捕获的目标分子浓度成正比。

现在让我们来了解一下一种常用的无标记光学传感技术——表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）的基本原理。典型的 SPR 仪器包含一个可移动的激光光源、一个用于测量光强变化的光学检测器，以及一块传感器芯片，该芯片由一个玻璃棱镜构成，其一侧表面镀有金膜。镀金的棱镜与一个流体系统集成，实现流通式操作。在实验中，探针分子（即生物识别元件）被固定在金膜表面，待测目标物随后流经该表面并与固定的探针结合。传感过程利用了 SPR 现象：当偏振光以特定角度 theta SPR 照射到金属（如金）表面时，会在金属与相邻介质的界面处激发表面等离子体，即具有相反介电常数符号的两种材料界面上存在的相干电子振荡。当传感器表面附着的质量发生变化时，表面等离子体的共振条件也随之改变。因此，当仅有生物识别元件结合在表面时，光束以某一角度 theta one 反射；而当表面附着更多质量（例如捕获的目标分子）时，反射光在特定角度 theta SPR 处的光强会降低，因为反射角变为 theta two。在共振角 theta SPR 处反射光强度的变化与反射角的变化相关，可表示为 theta one 与 theta two 之间的角度差值，并据此进行测量。

在了解了光学生物传感器的原理和操作流程之后，让我们来看看研究人员如今如何应用这些技术。流动池细胞仪是一种常用的光学生物传感系统，广泛用于细胞计数以及测量多种其他细胞特性与组分。首先制备包含多种细胞类型的样品，每种细胞均标记有独特的荧光染料，并悬浮于溶液中。随后将样品注入流式细胞仪，使细胞逐个通过激光束。当每个细胞穿过激光束时，不同荧光染料所产生的散射光和发射荧光被分别定量，从而直接获得样品中各类细胞的数量。光学生物传感器的另一个应用是检测样品中的细菌。其中一种方法是使用光学环形谐振器传感器。该传感器由一个闭合环路与输入和输出光波导耦合构成。当具有谐振波长的光被导入输入波导时，光会进入环路，并因相长干涉在多次循环中不断增强光强，最终从输出波导输出。针对细菌表面蛋白的特异性抗体被固定在环形谐振器表面，并首先获取基线吸收光谱。随后将待测细菌样品流经谐振器表面，使细菌与固定的抗体结合，之后再获取第二组吸收光谱。若目标细菌发生结合，则可观测到谐振峰出现明显偏移，且偏移程度与目标细菌的浓度成正比。

您刚刚观看了 JoVE 关于光学生物传感的视频。我们讨论了基于标记和无标记光学传感的基本原理，以及这些方法的两个典型示例和技术应用。感谢观看。