Name: Lidentificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri l'isolamento dei feromoni in Petromyzon marinus mediante estrazione in fase solida e cromatografia. Questo protocollo collega nuovi composti alla funzione feromonale per studi di ecologia chimica.

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Ringraziamo l'US Geological Survey Hammond Bay stazione biologica per l'utilizzo delle loro strutture di ricerca e il personale del U.S. Fish e Wildlife Service e della pesca e degli oceani Canada per la fornitura di lamprede di mare. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dalla Commissione per la pesca dei grandi laghi a Weiming Li e Ke Li.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Pesci vivono in un mondo chimico completo di composti ancora da identificare. Frazionamento analisi biologica-guida ha dimostrato essenziale per identificare e caratterizzare molecole bioattive che mediano molte interazioni chimiche, come quelle osservate in salmone masu31, elefanti asiatici32e lamprede di mare33, 34,35. Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio efficac...

I feromoni sono specifici segnali chimici rilasciati dagli individui che li aiutano nell'individuazione di fonti di cibo, rilevamento di predatori e mediare le interazioni sociali di conspecifici1. Comunicazione di feromone negli insetti è stato ben studiato2; Tuttavia, l'identificazione chimica e funzione biologica dei feromoni di vertebrati acquatici non sono stati studiati come ampiamente. Conoscenza dell'identità e della funzione dei feromoni rilasciati possono essere applicati per facilitare il recupero di specie minacciate3,4 o controllo dei parassiti specie5,6. L'applicazione di queste tecniche richiedono l'isolamento e la caratterizzazione dei componenti bioattivi feromone.
Identificazione di feromone è una branca della chimica dei prodotti naturali. Progresso nella ricerca di feromone è stato parzialmente limitato a causa della natura delle molecole feromone stesse. I feromoni sono spesso instabili e rilasciato in piccole quantità, ed esistono solo alcune tecniche di campionamento per rilevare piccole quantità di volatili7,8 o9di composti solubili in acqua. Approcci per identificare i feromoni includono 1) uno screening mirato di composti conosciuti, 2) metabolomica e frazionamento 3) analisi biologica-guida. Uno screening mirato di composti noti test disponibili in commercio sottoprodotti metabolici dei processi fisiologici supposti per funzionare come i feromoni. Questo approccio è limitante perché i ricercatori possono testare solo composti noti e disponibili. Tuttavia, ha provocato l'identificazione riuscita degli ormoni sessuali nel pesce rosso che la funzione come feromoni10,11,12. Metabolomica è un secondo metodo di identificazione di feromone che contraddistingue i prodotti metabolici piccola molecola potenziale all'interno di un sistema biologico13. Un confronto dei profili metabolici dei due gruppi (cioè, un attivo contro un estratto inattivo) consente l'identificazione di un profilo metabolico potenziale da cui il metabolita viene purificato, la struttura è stata chiarita e la bioattività è confermata14. Effetti additivi o sinergici delle complesse formulazioni di miscele specifiche sono più probabili essere rilevato con metabolomica poiché i metaboliti sono considerati insieme, piuttosto che come una serie di frazioni13. Ancora, l'implementazione della metabolomica si basa sulla disponibilità di riferimenti sintetici perché i dati risultanti non facilitano la delucidazione di nuove strutture.
Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio iterativo che si estende su due campi: chimica e biologia. Questo approccio utilizza i risultati delle analisi biologiche fisiologici e comportamentali per guidare l'isolamento e l'identificazione di un composto attivo feromone. Un estratto grezzo è frazionato da una proprietà chimica (cioè, dimensioni molecolari, polarità, ecc.) e testato con electro-olfactogram (EOG) registrazioni e/o in un'analisi biologica. I componenti bioattivi sono proiettati ripetendo questi passi di frazionamento ed EOGs e/o le analisi biologiche. Le strutture di composti attivi puri sono delucidate da metodi spettroscopici e spettrometrici, che forniscono il peso molecolare e strutturale informazioni per produrre un modello del composto da sintetizzare. Frazionamento analisi biologica-guida può produrre metaboliti diversi e potenzialmente romanzo feromoni con scheletri chimici unici che difficilmente essere predetto dalle vie biosintetiche.
Qui, descriviamo il protocollo di frazionamento analisi biologica-Guida utilizzato per isolare e caratterizzare la bioattività di lampreda di mare maschio sesso composti di feromone. La lampreda di mare (Petromyzon marinus) è un modello ideale di vertebrati di studiare comunicazione di feromone, perché questi pesci si basano molto sulla rilevazione olfattiva dei segnali chimici per mediare la loro storia di vita anadroma composto da tre fasi distinte: le larve, giovanile e adulto. Petromyzon marinus larve traforare il sedimento di corsi d'acqua dolce, subiscono una drastica metamorfosi e trasformano in novellame che migrano a un lago o un oceano dove essi parassitano pesci di host di grandi dimensioni. Dopo aver scollegato dal pesce host, gli adulti migrano indietro in flussi di deposizione delle uova, guidati dai migratori feromoni rilasciati da larve di flusso-residente15,16,17,18,19 . I maschi maturi salire verso le zone di riproduzione, rilascia un feromone sessuale multi-componente per ottenere gli accoppiamenti, in modo intermittente deporre le uova per circa una settimana e poi morire15,20. L'identificazione di feromoni lampreda di mare è importante poiché una modulazione del sistema di comunicazione di feromone è fra le opzioni considerate per controllare le lamprede di mare dilagante nel Laurentian Great Lakes21.

<table><tbody><tr><td>Capillari borosilicati a parete standard premium con filamento&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-4</td><td>elettrodo di registrazione e riferimento (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm)</td></tr><tr><td>Strumento estrattore per pipette</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>estrae elettrodi per EOG</td></tr><tr><td>Tagliavetro con punta di diamante</td><td>Punta tagliata generica</td><td></td><td>degli elettrodi per</td></tr><tr><td>capillari in vetro borosilicato</td> EOG <td>World Precision Instruments</td><td>1B150-4</td><td>tubo di erogazione odorizzante per EOG</td></tr><tr><td>Portaelettrodo di registrazione Serie E corpo dritto con pellet Ag/AgCl per capillare in vetro OD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>ESP-M15N</td><td>Portaelettrodo di registrazione Portaelettrodo</td></tr><tr><td>di riferimento Serie E con impugnatura con&nbsp; Ag/AgCl pellet&nbsp; per capillare in vetro OD 1,5 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>E45P-F15NH</td><td>portaelettrodo di riferimento</td></tr><tr><td>perno da 1 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>WC1-10</td><td>a ponte portaelettrodi di riferimento e di registrazione perno</td></tr><tr><td>da 2 mm</td><td>Warner</td><td>Instruments WC2-5</td><td>a ponte portaelettrodi di riferimento e registrazione</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td>agar fuso per riempire gli elettrodi</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>3M KCl per riempire elettrodi e portaelettrodi</td></tr><tr><td>Micropipetta microfil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G-5</td><td>per riempire elettrodi e portaelettrodi</td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td>odorizzante a controllo positivo per EOG</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Custom made</td><td>N/A</td><td>contiene odorizzanti per EOG</td></tr><tr><td>Estere etilico dell'acido 3-aminobenzoico (MS222)</td><td>Syndel USA</td><td>Tricaine1G</td><td>EOG anestetico</td></tr><tr><td>Gallamina trietioduro</td><td>Sigma</td><td>G8134-5G</td><td>EOG paralitico</td></tr><tr><td>1 mL siringa</td><td>BD Biosciences</td><td>301025</td><td>per somministrare</td></tr><tr><td>un ago sottocutaneo paralitico 26G 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305115</td><td>per somministrare un morsetto a rullo paralitico</td></tr><tr><td></td><td>World Precision Gli strumenti</td><td>14043-20</td><td>regolano la portata dell'anestetico nella bocca della lampreda</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td>per la preparazione di soluzione salina allo 0,9%</td></tr><tr><td>Supporto in plastica a forma di V come stadio del campione</td> Su <td>misura</td><td>N/A</td><td>tiene la lampreda durante l'EOG</td></tr><tr><td>Trogolo in plastica Su</td><td>misura</td><td>N/A</td><td>tiene il supporto in plastica a forma di V durante</td></tr><tr><td>EOG Lame per bisturi - #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>per dissezione EOG</td></tr><tr><td>Manico per bisturi - #3</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>per dissezione EOG</td></tr><tr><td>Pinze dritte ultra fini</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>per dissezione EOG, Dumont #5SF Pinze</td></tr><tr><td>Curvo ultra fine</td><td>Strumenti</td> per scienze fini <td>11370-42</td><td>per dissezione EOG, Moria MC40B</td></tr><tr><td>Forbici</td> <td>da pring diritteFine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>per la dissezione EOG</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Zeiss</td><td>Discovery V8</td><td>per la dissezione EOG</td></tr><tr><td>Luce illuminatore</td><td>Zeiss</td><td>CL 1500 ECO</td><td>per la dissezione EOG</td></tr><tr><td>Tubo in plastica</td><td>Generico</td><td></td><td>per collegare l'impianto EOG a ricircolo e i bagni d'acqua</td></tr><tr><td>Tubo di mandata odorizzante</td><td>Realizzato su misura</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>In set di filtri di linea e guarnizioni</td><td>Lee Company</td><td>TCFA1201035A</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatori</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>per posizionare gli elettrodi e il tubo capillare di erogazione dell'odorizzante</td></tr><tr><td>Dispositivi di tenuta magnetica</td><td>Kanetec</td><td>MB-K</td><td></td></tr><tr><td>Driver per valvole</td><td>Arduino</td><td>realizzato su misura</td><td>per controllare l'apertura della valvola per la stimolazione degli odori</td></tr><tr><td>Valvola elettromagnetica</td><td>Lee Azienda</td><td>LFAA1201618H</td><td>valvola per la stimolazione degli odori</td></tr><tr><td>NeuroLog Amplificatore AC/DC</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL106</td><td>per aumentare l'ampiezza del segnale elettrico</td></tr><tr><td>Preamplificatore DC NeuroLog con headstage</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL102G</td><td>per aumentare l'ampiezza del segnale elettrico</td></tr><tr><td>Filtro passa-basso 60 Hz</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>NL125</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>Axon Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Computer Dell (OptiPlex 745) con software di acquisizione dati per assoscopio</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>AxoScope versione 10.4</td><td></td></tr><tr><td>Gabbia di Faraday</td><td>Su misura</td><td>N/A</td><td>Schermatura dal rumore elettromagnetico</td></tr><tr><td>Labirinto a due scelte</td><td>Su misura</td><td>N/A</td><td>compensato marino impermeabilizzato ricoperto da rivestimento in plastica</td></tr><tr><td>Pompa per rifiuti</td><td>Honda</td><td>WT30XK4A</td><td>riempie il labirinto con l'acqua del fiume vicino</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica con tubi</td><td>Cole Parmer</td><td>Masterflex 07557-00</td><td>per amministrare gli odoranti nel labirinto</td></tr><tr><td>Generatore</td><td>inverter Honda</td><td>EU1000i</td><td>alimenta la pompa perstaltica</td></tr><tr><td>Gabbia di rilascio</td> Su <td>misura</td><td>N/A</td><td>utilizzato per acclimatare la lampreda nel labirinto</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>Generico</td><td></td><td>utilizzato per contenere le dimensioni del labirinto e ridurre al minimo la turbolenza dell'acqua con rulli a rete</td></tr><tr><td>Secchi (5 galloni)</td><td>Generico</td><td></td><td>per miscelare odoranti</td></tr><tr><td>Flussometro</td><td>Marsh-McBirney</td><td>Flo-Mate 2000</td><td>per misurare la portata</td></tr><tr><td>XAD 7 HP resina</td><td>Dow chemical</td><td>37380-43-1</td><td>per l'estrazione di acqua condizionata&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>per l'estrazione di acqua condizionata&nbsp;</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Yamato</td><td>BM 200</td><td>per l'estrazione di acqua condizionata&nbsp;</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco</td><td>CentriVap Concentratore</td><td>per l'estrazione di acqua condizionata</td></tr><tr><td>cloroformio</td><td>Sigma</td><td>CX1050</td><td>per l'isolamento di frazioni di piscine Gel di</td></tr><tr><td>silice 70-230 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>per l'isolamento di frazioni di piscine Gel di</td></tr><tr><td>silice 230-400 mesh</td><td>Sigma</td><td>112926-00-8</td><td>per l'isolamento di frazioni di</td></tr><tr><td>piscine Silice pre-rivestita piastre TLC in gel</td><td>Sigma</td><td>99571</td><td>per l'isolamento di frazioni di piscine</td></tr><tr><td>anisaldeide</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td>per l'isolamento di frazioni di frazioni</td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0090-01</td><td>per l'isolamento di frazioni di frazioni</td></tr><tr><td>Amberlite XAD 7 HP resina</td><td>Sigma</td><td>XAD7HP</td><td>per l'estrazione di acqua condizionata&nbsp;</td></tr><tr><td>4, colonne di vetro con capacità di 2,5 litri</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>5820</td><td>per l'estrazione di acqua condizionata&nbsp;</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>per l'estrazione di acqua condizionata&nbsp;</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa TQ-S TOF LC (o equivalente)</td><td>Waters Co.</td><td>N/A</td><td>per la delucidazione della struttura</td></tr><tr><td>Pompa HPLC binaria</td><td>Waters Co.</td><td>1525</td><td>per l'isolamento di pool/composti di frazioni</td></tr><tr><td>Spettrometro NMR Agilent, 900MHz (o equivalente)</td><td>Agilent</td><td>N/A</td><td>per la delucidazione della struttura</td></tr><tr><td>Sistema di essiccazione Rotovap</td><td>Buchi</td><td>RII</td><td>per l'estrazione di acqua condizionata&nbsp;</td></tr><tr><td>Lampada UV (254 nm)</td><td>Spectronics Co.</td><td>ENF-240C</td><td>per cromatografia su strato sottile&nbsp;</td></tr></tbody></table>

l'identificazione di feromoni petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-guida

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Frazionamento analisi biologica-guida è un approccio iterativo che utilizza i risultati delle analisi biologiche fisiologici e comportamentali per guidare l'isolamento e l'identificazione di un composto attivo feromone. Questo metodo ha provocato la riuscita caratterizzazione dei segnali chimici che funzionano come i feromoni in una vasta gamma di specie animali. Lampreda di mare si basano su olfatto per rilevare i feromoni che mediano le risposte comportamentali o fisiologiche. Usiamo questa conoscenza della biologia dei pesci a postulare funzioni di putativi feromoni e per guidare l'isolamento e l'identificazione dei componenti attivi di feromone. Cromatografia è usata per estrarre, concentrarsi e separare composti dall'acqua climatizzata. Electro-olfactogram (EOG) registrazioni sono condotte per determinare quali frazioni elicitare risposte olfattive. Analisi comportamentale di due-scelta labirinto vengono quindi utilizzate per determinare se uno qualsiasi delle frazioni odorose sono anche relativamente al comportamento attivo e indurre una preferenza. Spettroscopici e spettrometrici metodi forniscono il peso molecolare e strutturale informazioni per assistere con la delucidazione della struttura. La bioattività dei composti puri è confermata con analisi comportamentale ed EOG. Le risposte comportamentali osservate nel labirinto, in definitiva, devono essere convalidate in un ambiente di campo per confermare la loro funzione in un ambiente naturale flusso. Queste analisi biologiche giocano un doppio ruolo per 1) guida il processo di frazionamento e 2) confermare e definire ulteriormente la bioattività di componenti isolati. Qui, segnaliamo i risultati rappresentativi di un'identificazione del feromone di lampreda di mare che esemplificano l'utilità dell'approccio frazionamento analisi biologica-guida. L'identificazione di feromoni lampreda di mare è particolarmente importante poiché una modulazione del suo sistema di comunicazione di feromone è fra le opzioni considerate per controllare la lampreda di mare dilagante in grandi laghi Medicea Laurenziana. Questo metodo può essere facilmente adattato per caratterizzare la comunicazione chimica in una vasta gamma di taxa e gettare luce sull'ecologia chimica a base acquosa.

Nella Figura 1è riportato un diagramma che riassume i passaggi descritti nel protocollo del frazionamento analisi biologica-guida. Il protocollo prevede passaggi per isolare e caratterizzare la struttura, la potenza olfattiva e l'attività comportamentale di 5 Petromyzon marinus putativi feromoni (Figura 2). Utilizzando la spettrometria di massa e dati NMR (Figura 3 e Figura 4</st...

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e caratterizzare la struttura, la potenza olfattiva e la risposta comportamentale dei composti di feromone presunto di lamprede di mare.

L'identificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ecologia chimica, come l'identificazione dei feromoni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che collega nuovi composti alla funzione dei feromoni. Per iniziare questa procedura, metti 15-30 lamprede di mare maschi sessualmente maturi in una vasca alimentata con 250 litri di acqua aerata del Lago Huron, mantenuta a 16-18 gradi Celsius.Per estrarre l'acqua condizionata mediante estrazione in fase solida, passarla dal serbatoio attraverso il sistema di pompaggio fino alla sommità della colonna. L'acqua passa attraverso un letto di due chilogrammi di resina polimerica a scambio ionico moderatamente polare contenuta in una serie di quattro colonne di vetro da un litro di capacità. Successivamente, rimuovere il solvente organico e raccogliere l'estratto mediante evaporazione rotativa per cinque ore a pressione ridotta a 40 gradi Celsius.Per isolare i pool di frazione, immergere il gel di silice nella fase mobile iniziale per 30 minuti. Trasferire il gel con il solvente in una colonna di vetro e aprire la valvola per consentire il passaggio della fase mobile. Quindi, mescolare accuratamente gli estratti con gel di silice e caricarli nella colonna per cromatografia liquida sopra il letto di gel di silice.Eluirli con un gradiente dal 95% di cloroformio a metanolo al 100% di metanolo, per un totale di 2,5 litri, quindi raccogliere l'eluente in singole fiale da 10 millilitri. Successivamente, eseguire l'esperimento TLC su piastre di gel di silice pre-rivestite applicando il campione sulla linea di partenza e immergendo la linea di partenza della piastra nel solvente di sviluppo in un serbatoio di vetro sigillato. Dopo che il solvente di sviluppo ha raggiunto la linea di finecorsa, estrarre la piastra dal serbatoio e attendere 10 minuti affinché il solvente evapori.Visualizzare le macchie, prima sotto la luce UV a 254 nanometri, quindi colorare la lastra spruzzandola con una soluzione acida di metanolo al 5% di anisaldeide utilizzando uno spruzzatore per cromatografia e riscaldandola a 85 gradi Celsius per tre minuti. Successivamente, concentrare la frazione in un residuo mediante evaporazione rotativa a pressione ridotta a 40 gradi Celsius per circa 30 minuti. Per eseguire la registrazione EOG, riempire gli elettrodi capillari polari e i portaelettrodi allo stato solido, prefabbricati con pellet di cloruro d'argento-argento, con cloruro di potassio a tre molari utilizzando una micropipetta.Quindi, inserire gli elettrodi polari nei portaelettrodi. Successivamente, preparare 100 millilitri di L-arginina da 10 a meno cinque molari in acqua filtrata a carbone da una soluzione madre di L-arginina da 10 a meno due molari in acqua deionizzata in un matraccio tarato. Per la curva concentrazione-risposta, preparare 10 millilitri di diluizioni di 10 volte dei pool di frazioni.Ora, orienta una lampreda anestetizzata in un supporto a forma di V e avvolgila con un tovagliolo di carta bagnato per evitare che si secchi. Inserire un tubo di acqua aerata a ricircolo contenente 50 milligrammi per litro di MS222 nella cavità buccale. Regolare la portata e assicurarsi che l'acqua esca attraverso le aperture branchiali per irrigare continuamente le branchie.Sciacquare il tubo di mandata dell'odorizzante con acqua filtrata e collegarlo alla valvola montata su un micromanipolatore. Quindi, posizionare il tubo capillare di erogazione dell'odorizzante nella cavità dell'epitelio olfattivo per erogare acqua filtrata all'epitelio olfattivo per prevenire l'essiccazione quando non si somministrano odorizzanti. Quindi, montare gli elettrodi di registrazione e di riferimento sui micromanipolatori.Abbassare l'elettrodo di riferimento sulla pelle esterna vicino alle narici. Utilizzando il microscopio stereoscopico, abbassare l'elettrodo di registrazione fino a toccare appena la superficie dell'epitelio olfattivo. Successivamente, trasferire l'assorbimento del tubo di erogazione dell'odorizzante dall'acqua filtrata di fondo alla soluzione di L-arginina da 10 a meno cinque molari.Accendi il computer, l'amplificatore, il filtro e il digitalizzatore. Utilizzando il software del driver della valvola, programmare la procedura per somministrare un singolo impulso di quattro secondi di odorizzante selezionando la casella di T1, impostando T su quattro secondi e selezionando la casella di T2.In il software di acquisizione dati, impostando la modalità di acquisizione su un oscilloscopio ad alta velocità. Fare clic sull'icona Riproduci, quindi fare clic su Avvia nel driver della valvola per attivare l'impulso dell'odore.Inizia a registrare il controllo del bianco, la L-arginina, e poi gli odoranti da basse ad alte concentrazioni con un lavaggio di due minuti di acqua filtrata tra un'applicazione e l'altra. Per identificare le frazioni comportamentali attive, acclimatare la femmina di lampreda di mare sessualmente matura nella gabbia di rilascio nel labirinto per cinque minuti. Rilasciare la lampreda di mare e registrare la quantità cumulativa di tempo che la lampreda trascorre nel canale sperimentale e nel canale di controllo, ciascuno contenente acqua di fiume, per 10 minuti.Successivamente, applicare lo stimolo di prova al canale sperimentale assegnato in modo casuale nel veicolo al canale di controllo utilizzando pompe peristaltiche a velocità costanti di 200 millilitri al minuto per cinque minuti, quindi applicare lo stimolo di prova nel veicolo per altri 10 minuti e registrare la quantità cumulativa di tempo che la lampreda trascorre nei canali sperimentale e di controllo. In questa procedura, purificare ulteriormente le frazioni attive in composti con cromatografia ad esclusione dimensionale utilizzando una colonna sephadex LH-20. Preparare il campione in 0,5 millilitri della fase mobile iniziale, caricandolo nella colonna cloroformio-metanolo e poi nella colonna metanolo, ed eluire le frazioni attive per ottenere il composto.Sciogliere e diluire il composto purificato nella fase mobile iniziale dell'HPLC per formare una soluzione da 10 microlitri di circa un microgrammo per millilitro. Quindi, trasferire la soluzione campione nelle fiale HPLC e inserirle nell'autocampionatore di HPLC. Iniettare il campione nella spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray e registrare gli spettri di spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray ad alta risoluzione utilizzando uno spettrometro di massa cromatografico.Sciogliere completamente il campione nei solventi deuterati selezionati per formare una soluzione con una concentrazione compresa tra 0,1 e 10 milligrammi per millilitro circa. Trasferire la soluzione del campione in un tubo NMR per registrare gli spettri NMR 1D e 2D su uno spettrometro NMR da 900 megahertz. Qui è mostrato uno spettrometro NMR da 600 megahertz.Sono stati identificati cinque nuovi feromoni putativi di lampreda di mare e le loro strutture sono state chiarite con metodi spettrometrici e spettroscopici. Questi feromoni putativi erano stimolatori per l'epitelio olfattivo della lampreda di mare adulta e avevano basse soglie di rilevamento nelle registrazioni dell'elettro-olfattogramma. Nei saggi comportamentali del labirinto a due scelte, le femmine di lampreda di mare ovulate sono state attratte dalla petromyzone A, dal petromyzene A e dal petromyzene B e respinte dalla petromyzone C.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la cristallografia a raggi X e le reazioni di derivatizzazione per rispondere a ulteriori domande come la stereochimica dei composti. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dei prodotti naturali e della neuroetologia per esplorare la biosintesi plausibile e la funzione biologica dei feromoni negli organismi acquatici come la lampreda di mare. Non dimenticare che lavorare con il cloroformio può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come lavorare nel cappuccio chimico, indossare guanti e occhiali di sicurezza, dovrebbero essere sempre prese durante la manipolazione di questo reagente.

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Scopri l'isolamento dei feromoni in Petromyzon marinus mediante estrazione in fase solida e cromatografia. Questo protocollo collega nuovi composti alla funzione feromonale per studi di ecologia chimica.

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