Name: פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: חקור סינתזת חלבונים דינמית בלב עכבר באמצעות פרופיל פוליזומים. שיטה זו מאפשרת זיהוי mRNA לתרגום, miRNA וחלבוני פוליזום בתגובה ללחץ לבבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HL112730 NIH P01 (סמרטוט, JVE), NIH R01 HL132075 (סמרטוט, JVE), מרכז הלב של ברברה סטרייסנד נשים (סמרטוט, JVE), דורותי, ליון פיליפ אי יו ר בקרדיולוגיה מולקולרית (סמרטוט), אריקה גלייזר ניחן כסא בריאות הלב של האישה (JVE), האקדמיה למדעים הצ'כי תמיכה מוסדית RVO: 68081715 (MS).

<ol><li>Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+pseudohypoxia+targets+ambra1+mrna+to+p-bodies+for+translational+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression.</a> PLoS ONE. 10, e0129750(2015).</li>
<li>Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+in+atrial+tissue+of+patients+undergoing+heart+surgery+with+cardiopulmonary+bypass%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass.</a> JCI Insight. 2, e89303(2017).</li>
<li>Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+Combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+trafficking+of+transcripts+and+micrornas+in+regenerating+liver+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).</li>
<li>Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+Mirnas+and+mrnas+in+ischemic+preconditioning+and+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Lorsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+enzymology.+Laboratory+methods+in+enzymology%3A+Rna.+Preface%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface.</a> Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).</li>
<li>Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+polysomal+fractions+from+mouse+brain+synaptoneurosomes+and+analysis+of+polysomal-bound+mrnas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Molotski, N., Soen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+association+of+micrornas+with+polysomes+reflects+distinct+strengths+of+interactions+with+their+mrna+targets%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets.</a> RNA. 18, 1612-1623 (2012).</li>
<li>Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+micrornas+are+associated+with+translating+messenger+rnas+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).</li>
<li>Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mirnas+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interplay between mirnas and human diseases.</a> Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).</li>
<li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrna+therapeutics%3A+Towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).</li>
<li>Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mirnp%3AMrna+association+in+polyribosomes+in+a+human+neuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line.</a> RNA. 10, 387-394 (2004).</li>
<li>Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+let-7a+mirna+blocks+protein+production+on+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).</li>
<li>Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+many+micrornas+that+copurify+with+polyribosomes+in+mammalian+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).</li>
<li>Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-linked+microrna-21+exhibits+drastically+reduced+mrna+binding+and+silencing+activity+in+healthy+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver.</a> RNA. 18, 1510-1526 (2012).</li>
<li>Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+rna-binding+protein+hu+antigen+r%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).</li>
<li>McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+azidohomoalanine+labeling+in+mammals+%28palm%29+detects+changes+in+liver-specific+lkb1+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice.</a> Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).</li>
<li>Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+biotinylated+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6, 359-362 (2009).</li>
<li>Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichloroacetic+acid-induced+protein+precipitation+involves+the+reversible+association+of+a+stable+partially+structured+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate.</a> Protein Science. 18, 980-993 (2009).</li>
<li>Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+protein+precipitation+methods+for+various+rat+brain+structures+prior+to+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis.</a> Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).</li>
<li>Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+quantitative+mass+spectrometry+and+electron+microscopy+analysis+of+ribosomal+30s+subunit+assembly+in+e.+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli.</a> Elife. 3, (2014).</li>
<li>Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ניתוח הפרופיל polysome מאפשר המחקר של תרגום חלבונים על-ידי ניתוח המדינה translational של mRNA ספציפי או את כל transcriptome6,7. זה גם לעזר רב כאשר תרגום מקומי צריך להילמד כמו synaptosomes8. באופן מסורתי, שיטה זו כרוכה ההפרדה של מונו - polyribosomes ואת mRNAs המשויך את הדרגה סוכרוז אשר יכול להיות בשילוב עם גנומית או פרוטיאומיה מבנית הטכניקות להשגת תוצאות המיועד6,9. למשל, מחקר שנערך ...

הלב מגיב לפציעה של איסכמיה (I), פגיעה reperfusion (R) בצורה דינמית. עם זאת, יש קצת תובנה חריפה לשינויים סינתזת חלבונים במהלך התגובה. כדי לטפל בבעיה זו, לקחנו היתרון של השיטה ומבוססת של polysome פרופיל1 כדי לזהות שינויים בשפע חלבון המשקפים הפצה של הריבוזומים ו translational גורמים רגולטוריים מ ציטוזול כדי polysomes, ו לודיג לאחרונה מסונתז חלבונים (NSPs). בסביבה של אני / R, הגדלת סינתזת החלבון החדש מתרחש במסגרת זמן זה אינו עולה בקנה אחד עם שעתוק של mRNAs חדש2; יתר על כן, הכתבים בין רמות הביטוי mRNA ושפע חלבון כבר דווח על3. מסיבות אלה, בחרנו לנתח השינויים פרוטאום דינמי כפי שהיא משתקפת תרגום החלבון. כדי לעשות זאת, אנחנו לכמת mRNA שברים polysome, ולנתח את הרכב החלבון בשברים polysome. לבסוף, מאחר מיקרו Rna (מירס) לווסת את הזמינות של mRNAs לתרגום יכולים להפריע היעילות של חלבון תרגום4,5, בדקנו את ההפצה של מירס בחלקים polysome, התמקדות תגובה / רבי
בחרנו להשתמש בעכבר מבודד Langendorff זלוף המודל לבין רקמת שנקטפו בתנאים הבזליים של רציף זלוף, אחרי איסכמיה זרימה לא גלובלי 30 דקות, ואחרי 30 דקות של איסכמיה ואחריו 30 דקות של פגיעה reperfusion. אנחנו solubilized את רקמת הלב ואז מופרדים polysomes מעבר הדרגתי סוכרוז, ואחריו פרוטיאומיה מבנית ניתוח וזיהוי סלקטיבי של mRNAs ושל miRNAs ע י PCR microarray, בהתאמה. שילוב זה של שיטות מייצג גישה רב-עוצמה להבנת פרוטאום דינמי, המאפשר זיהוי סימולטני של mRNA, miRNA, NSPs, כמו גם הפצה מחדש של חלבוני, miRNA ו- mRNA בין שברים nontranslating, יעילות נמוכה polysomes, יעילות גבוהה polysomes (ראה איור 1). תובנות ברגולציה דינמי של תהליך זה יורחב על ידי ניתוח נוסף של זירחון של גורמים רגולטוריים מרכזיים כגון eIF2α או mTOR. צעדים בודדים אלה מתוארים עכשיו בפירוט.

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital</td><td>Vortech Phamaceuticals</td><td>9373</td><td>להמתת חסד</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sagent</td><td>103424</td><td>המשמש במלקחיים להכנת לנגנדורף</td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>91110-10</td><td>המשמש לתליית הלב</td></tr><tr><td>מערכת Langendorff</td><td>Radnoti + תוצרת בית</td><td>n/a</td><td>מערכת 'ארבעה לבבות' המורכבת מזכוכית מנופחת בהתאמה אישית, צינורות ואמבטיות מים</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-5KG</td><td>מאגר קרבס ושיפוע סוכרוז</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>מאגר קרבס ומאגר ליזה</td></tr><tr><td>KH2PO42</td><td>Sigma</td><td>P-5504</td><td>מאגר קרבס</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7774-500G</td><td>מאגר קרבס</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא</td><td>G5767</td><td>מאגר קרבס</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>מאגר קרבס</td></tr><tr><td>אבקת סוכרוז</td><td>Sigma</td><td>S0389-1KG</td><td>שיפוע סוכרוז</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>208337</td><td>שיפוע סוכרוז ומאגר ליזה</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>שיפוע סוכרוז ומאגר ליזה</td></tr><tr><td>קסילן ציאנול</td><td>סיגמא</td><td>X-4126</td><td>שיפוע סוכרוז</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-aldrich</td><td>239763</td><td>שיפוע סוכרוז ומאגר ליזה</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies</td><td>C00019</td><td>מעכב RNAse למאגר ליזה</td></tr><tr><td>Igepal CA-360 (NP40)</td> <td>Sigma</td><td>I3021</td><td>מאגר ליזה</td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז טבליות קוקטייל, רוש 5056489001</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ללא EDTAצינור, דופן דקה, שקוף במיוחד, 13.2 מ"ל, 14 מ"מ x 89 מ"מ</td><td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>LE-80K</td><td>אולטרה-צנטריפוגה של השיפועים</td></tr><tr><td>רוטור</td><td>בקמן</td><td>SW41</td><td>אולטרה-צנטריפוגה של השיפועים</td></tr><tr><td>Biologic LP (משאבה)</td><td>Biorad</td><td>731-8300</td><td>פיצול השיפועים</td></tr><tr><td>BioFrac</td><td>Biorad</td><td>741-0002</td><td>פיצול השיפועים</td></tr> צינורות <tr><td>מיקרוצנטריפוגה של Eppendorf RNA/DNA LoBind, צינור 2 מ"ל</td><td>Sigma</td><td>Z666513-100EA</td><td>שבר שיפוע ומיצוי RNA</td></tr><tr>טכנולוגיות חיים<td>מגיב TRIzol טכנולוגיות</td><td>חיים</td><td>AM9738</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>בקרת לוציפראז מיצוי RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר מדעי</td><td>C606-4</td><td>RNA מיצוי</td></tr><tr><td>גליקוגן, דרגת RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא</td><td>E7023-1L</td><td>מיצוי RNA</td></tr><tr><td>iScript cDNA ערכת סינתזה</td><td>BioRad</td><td>170-8891</td><td>שעתוק הפוך</td></tr><tr><td>iTaq אוניברסלי SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>175-5122</td><td>PCR קוונטי</td></tr><tr><td>miRNeasy Micro Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217084</td><td>Kit לבידוד RNA כולל</td></tr><tr><td>miScript II RT Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Kit לשעתוק הפוך של miRNA</td></tr><tr><td>miScript Sybr Green PCR Kit (200)</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Kit לניתוח ביטוי PCR בזמן אמת של miRNAs</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>לצנטריפוגה של צינורות של 1.5 מ"ל או 2.0 מ"ל בטמפרטורות שונות. מהירות מקסימלית - 21130 x g</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>לצנטריפוגה של לוחות PCR בזמן אמת בטמפרטורות שונות. מהירות מקסימלית - 2039 x g</td></tr><tr><td>My Cycler Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>לשעתוק הפוך</td></tr><tr><td>CFX96 מערכת בזמן אמת/C1000 מגע Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>לניתוח PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>miRNeasy סרום/פלזמה בקרת ספייק אין</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td>לבקרת איכות של בידוד RNA</td></tr><tr><td>לוחות PCR קשיחים 96 בארות, פרופיל נמוך, קיר דק, חצאית, ירוק/שקוף</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9641</td><td>לניתוח PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>Microseal 'B' PCR Plate Seal Seal, דבק,</td><td>MSB1001 Bio-Rad</td><td></td> אופטי <td>לאיטום לוחות PCR בזמן</td></tr><tr><td>אמת מחקר בתוספת פיפטה חד-ערוצית, אפור; 0.5-10 ומיקרו; L</td><td>Eppendorf</td><td>UX-24505-02</td><td>לפיפטינג</td></tr><tr><td>פיפטמן פיפט קלאסי, P20</td><td>גילסון</td><td>F123600G</td><td>לפיפטינג</td></tr><tr><td>פיפטמן פיפט קלאסי, P200</td><td>גילסון</td><td>F144565</td><td>לפיפטינג</td></tr><tr><td>Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS פיפטה 100-1000 ומיקרו; L</td><td>Gilson</td><td>17011782</td><td>עבור פיפטינג</td></tr><tr><td>גליקוגן, דרגת RNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>משפר את יעילות בידוד ה-RNA הכוללת</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 מ"ל צינורות, צבע טבעי</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>בידוד ואחסון RNA; תערובת ריאגנטים</td></tr><tr><td>צינורות רכיבה תרמית -0.2 מ"ל כובעים בודדים, צינורות סטנדרטיים של 0.2 מ"ל עם אופטית</td><td>Denville</td><td>C18098-4 (1000910)</td><td>תגובת שעתוק הפוכה</td></tr><tr><td>שארפ 10 טיפים מחסום דיוק</td><td>דנוויל</td><td>P1096-FR</td><td>עבור פיפטינג</td></tr><tr><td>חד 20 טיפים מחסום דיוק</td><td>דנוויל</td><td>P1121</td><td>עבור פיפטינג</td></tr><tr><td>חד 200 טיפים מחסום מדויק</td><td>דנוויל</td><td>P1122</td><td>עבור טיפים לפיפטינג</td></tr><tr><td>LTS 1 מ"ל מסנן</td><td>Rainin</td><td>RT-L1000F</td><td>עבור פיפטינג</td></tr><tr><td>miScript מבחן פריימר ( 200)</td> <td>Qiagen</td> <td>(זה משתנה בהתאם ל-miRNA)</td> <td>לניתוח PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>Gradient Master ver 5.3 Model 108</td><td>BioComp Instruments</td><td></td><td>להכנת שיפועי סוכרוז</td></tr><tr><td>חומצה טריכלורואצטית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride</td><td>Amresco</td><td>M108</td><td></td></tr><tr><td>דיתיותרייטול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>Gbiosciences</td><td>RC-150</td><td></td></tr><tr><td>ריצוף טריפסין שונה בדרגת ריצוף, חזיר</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>BDH</td><td>BDH9206</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית, אופטימה LC/MS</td><td>פישר כימיקל</td><td>A117</td><td></td></tr><tr><td>מתנול, אופטימה LC/MS</td><td>פישר כימיקל</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל, אופטימה LC/MS</td><td>פישר כימיקל</td><td>A996</td><td></td></tr><tr><td>חלבון LoBind צינורות 0.5 מ"ל</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431064</td><td></td></tr><tr><td>חלבון LoBind צינורות 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf AG</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>HLB ומיקרו; צלחת סילוק 30 ומיקרו; m</td><td>Oasis</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>רכז SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>Savant SPD2010</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור</td><td>Qsonica</td><td>Oasis180</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall Legend micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>LC עמוד מלכודת PepMap 100 C18</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td></td></tr><tr><td>עמודת הפרדה LC PepMap RSLC C18</td><td>ספקטרומטר מסה Thermo Scientific</td><td>164536</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Orbitrap Elite מלכודת יונים ספקטרומטר</td><td></td>מסה</tr><tr><td>MSConvert תוכנה</td><td>ProteoWizard Toolkit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Sorcerer-SEQUEST</td><td>Sage-N Research, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה mirna ניתוח של polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף langendorff

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

לימודי שינויים דינמיים בתרגום חלבונים דורשים שיטות מיוחדות. כאן נבחנו שינויים בחלבונים מסונתז לאחרונה, בתגובה איסכמיה, פגיעה reperfusion באמצעות הלב העכבר perfused מבודדים בשילוב עם polysome פרופיל. כדי להבין עוד יותר את השינויים הדינמיים בתרגום חלבונים, אנחנו מאופיין mRNAs זה היו מפוצצות ריבוזומים cytosolic (polyribosomes או polysomes) וגם התאושש polysomes מיטוכונדריאלי ו לעומת התפלגות mRNA וחלבון ב יעילות גבוהה שברים (מצורף mRNA הריבוזומים רבים), נמוך-יעילות (פחות ריבוזומים מצורף) אשר כללה גם את polysomes מיטוכונדריאלי, השברים ללא תרגום. miRNAs ניתן גם לשייך mRNAs זה מתורגם, ובכך להפחית את היעילות של תרגום, שבדקנו את חלוקת miRNAs לאורך השברים. ההתפלגות של mRNAs, miRNAs חלבונים נבדק בתנאים perfused הבזליים, בקצה של 30 דקות של איסכמיה זרימה לא גלובלי, ואחרי 30 דקות של פגיעה reperfusion. כאן אנו מציגים את שיטות השתמשו כדי לבצע ניתוח זה — בפרט, הגישה אופטימיזציה של חלבון החילוץ של מעבר הצבע סוכרוז, כמו זה לא תואר קודם — ולספק תוצאות נציג.

ניתוח ה-mRNA תוצאות ה-mRNA ניתן לבטא הפצת mRNA מסוים בתוך כל שבר (איור 3 א); על כימות, לשלב שברים תרגום polyribosomal, להשוות תרגומים שאינם השבר (איור 3B), מציג יחס של mRNA שפע בתרגום כדי שברים nontranslating. פרטים נוספים נרכשת על ידי בחינת שברים polysome יעילות גבוהה בנפרד מן יעילות נמוכה polysome שברים (, ונבדלת שברים nontranslating). הדבר חשוב במיוחד בעת ניתוח miRNAs, אשר הם מועשרים בשברים יעילות נמוכה (איפה הם מפ...

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע polysome פרופיל על הלב העכבר perfused מבודדים. אנו מתארים שיטות הלב זלוף, polysome פרופיל של ניתוח של שברים polysome ביחס mRNAs miRNAs, את פרוטאום polysome.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי סינתזת חלבון דינמית והפרוטאום המעורב בתהליך. טכניקה זו מאפשרת לזהות את ה-mRNA שנבחרו לתרגום, את המיקרו-רנ"א שיכולים להשתתף בתהליך ולהפריע לתרגום, ואת החלבונים התורמים לתרגום החלבונים או שהם עצמם מתורגמים. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי תגובות לבביות ללחץ, אך ניתן ליישם אותה גם לחקר תגובות חריפות ללחץ באיברים אחרים.מי שתדגים את ההליך תהיה מירוסלבה סטסטנה, מדענית הפרויקט מהמעבדה של ג'ניפר ואן אייק. ביום הניסוי, מלאו את התא השמאלי של מערבל שיפוע בחמישה מיליליטר של תמיסת שיפוע סוכרוז של 15%, ומלאו את התא הימני בחמישה מיליליטר של תמיסת שיפוע סוכרוז של 50%. פתח את הברז והפעל את המשאבה כדי לערבב את שני התאים הקטנים בעזרת מערבל מגנטי, והשתמש בצינור המקושר לברז השני כדי לאפשר לתמיסות הסוכרוז המעורבות לזרום לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה יחיד עם קירות דקים על קרח.לאחר מכן, הומוגניזציה של רקמת הלב הטרייה או הקפואה עם POLYTRON במאגר ליזה מסונן למשך 15 שניות על קרח. בסוף הדגירה, צנטריפוגה את הליזאט כדי להסיר את החומר הבלתי מסיס, ולקצור את הסופרנטנט. הקצו 50 מיקרוליטר של הסופרנטנט לקביעת חלבון, בידוד רנ"א וניתוח שלמות רנ"א, ושכבה של 100 עד 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט הנותר מעל תמיסת השיפוע.השתמש במאגר ליזה טרי כדי לאזן את הנפחים בין שני צינורות השיפוע, ואולטרה-צנטריפוגה את הדגימות באולטרה-צנטריפוגה עם רוטור דלי מתנדנד. היזהר מאוד לא להפריע לשיפוע הסוכרוז לפני או אחרי הצנטריפוגה. כדי לאסוף את השיפועים, תכנת את אספן השברים להשליך את שלוש הדקות הראשונות של האיסוף ולאסוף את השברים הכבדים, הקלים והלא מתרגמים במהירות של מיליליטר לדקה ב-17 שברים מארבע עד 19 דקות עם ניטור רציף של הספיגה ב-254 ננומטר.הניחו כל שבר על קרח ברגע שהוא נאסף. לאחר מכן אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס, אם הן לא מעובדות באופן מיידי. כדי לחלץ חלבונים משברי הפוליזום, שלב את שברי הסוכרוז שנאספו לשלושה שברים סופיים, וסמן את השברים ככבדים, קלים ולא מתורגמים.מערבבים 0.5 מיליליטר מכל דגימה עם 60 מיקרוליטר של 100% חומצה טריכלורואצטית, או TCA. דגרו את השברים למשך הלילה במינוס 20 מעלות צלזיוס בחושך. למחרת בבוקר, הפשירו את הדגימות על קרח לפני שגלגלו את החלבונים על ידי צנטריפוגה.השליכו את הסופרנטנטים, ושטפו את הכדורים פעמיים עם 0.5 מיליליטר מינוס 20 מעלות צלזיוס אצטון צונן לכל צנטריפוגה. ודא שהגלולה, לאחר משקעי TCA, מומסת לחלוטין, באמצעות סוניקציה דופק כדי להבטיח מסיסות מלאה, לפי הצורך. יבש את הכדורים באוויר לאחר הכביסה האחרונה לפני ההשעיה מחדש ב-360 מיקרוליטר של מאגר Tris-HCl.לאחר מכן הוסיפו 40 מיקרוליטר דיתיותרייטול לדגירה של 45 דקות בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס עם ניעור. בתום הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר של יודואצטמיד לדגימות לדגירה של 30 דקות על השייקר בטמפרטורת החדר, מוגן מאור, ולאחר מכן עיכול הדגימות עם יחס משקל למשקל של 1 ל-50 טריפסין לחלבון לדגירת טלטול לילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לאחר הקירור, צנטריפוגה קצרה של הדגימות, והתאם את ה-pH לשתיים עד שלוש עם 10% חומצה פורמית כדי להרוות את פעילות הטריפסין.כדי להפיל את הדגימות, תחילה יש לתקן את הספיגה בבארות של צלחת של 96 בארות עם 200 מיקרוליטר מתנול שלוש פעמים, ולאחר מכן מיזוג עם 200 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית לבאר שלוש פעמים. לאחר מכן, טען את הדגימות על כל באר, ושטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית לכל שטיפה. באמצעות כוח הכבידה, ואחריו ואקום נמוך, יש להוציא את הדגימות עם 100 מיקרוליטר של 0.1% חומצה פורמית ב-50% אצטוניטריל פעמיים לתוך שפופרת אחת של 0.5 מיליליטר עם שימור חלבון נמוך לכל דגימה.לאחר מכן השתמש ברכז כדי לאדות את הדגימה מתפשטת ליובש, ולבנות מחדש כל כדור פפטיד טריפטי ב-50 עד 100 מיקרוליטר של חומצה פורמית של 0.1% לניתוח ספקטרומטריית מסה. ניתן לבצע ניתוח mRNA כדי להעריך את ההתפלגות של mRNA מסוים מעניין בכל שבר או לכימות והשוואה של שברי התרגום הפוליריבוזומליים המשולבים לשבר הלא מתורגם כיחס של שפע mRNA בכל שבר. לדוגמה, כאן, מוצגים השינויים בהתפלגות ה-mRNA על פני השברים המתרגמים והלא מתרגמים לאחר הכפפת לב העכבר לאיסכמיה או איסכמיה, בהשוואה לטיפול בלב דמה.בניסוי מייצג זה, ניתוח תת-קבוצה של מיקרו-רנ"א בשברים הכבדים המאוגדים גילה כי 22 מיקרו-רנ"א היו קשורים לפוליזומים במהלך איסכמיה, תשעה היו קשורים במהלך איסכמיה ורפרפוזיה, ושבעה היו משותפים לשני המצבים, מה שמדגים כי הקשר של מיקרו-רנ"א הוא דינמי בתגובה ללחצים של איסכמיה ורפרפוזיה. יתר על כן, רוב החלבונים הריבוזומליים המיטוכונדריאלים זוהו בשבר הקל, ורוב החלבונים הריבוזומליים הציטוזוליים זוהו בדרך כלל הן בשברים הכבדים והן בשברים הקלים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיזהר מאוד עם שיפוע הסוכרוז.משקעי TCA למיצוי חלבונים משברי פוליזום נבחרו בזרימת העבודה שלנו על סמך היכולת לעבד את השבר בריכוז גבוה של סוכרוז ומספר החלבונים שזוהו על ידי ספקטרומטריית מסה. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו עשויים להיאבק בגלל האתגרים הקשורים לשחזור של שיפוע הסוכרוז. משקעי TCA הם יתרון מכיוון שנדרשים רק נפחים קטנים כדי לזרז את החלבונים, הגלולה נראית בתחתית הצינור, ואין הצטברות של סוכרוז במהלך המשקעים.

dynamic-proteomic-mirna-analysis-polysomes-from-isolated-mouse-heart

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרופוזיה של לב מבודד במצב Langendorff, בשילוב עם ספקטרוסקופיית 31P NMR, מאחדת את תחומי הביוכימיה והפיזיולוגיה לניסוי אחד. הפרוטוקול מאפשר מדידה דינמית של תכולת פוספט בעלת אנרגיה גבוהה ומחזוריותה בלב, תוך ניטור סימולטני של התפקוד הפיזיולוגי. כאשר היא מבוצעת נכון, טכניקה זו מהווה כלי בעל ערך להערכת האנרגטיקה של הלב.

הערכה של תפקוד הלב Energetics בלבבות עכבר בודדות שימוש 31 P NMR ספקטרוסקופיה

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה...

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

ניתוח ביטוי החלבון במסתמי עכברים עובריים צעירים נפגע על ידי הרקמה המוגבלת הזמינה. כתב יד זה מספק פרוטוקול להכנת חלבון מאזורי שסתום עכבר עובריים מתפתחים לניתוח כתמים מערביים.

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

מיקרו-RNAs (miRNAs) הם רצפי RNA הומולוגי מאוד וקצר, הגשה הרגולטורים post-transcriptional RNAs שליח (mRNAs). שיטות איתור miRNA הנוכחית להשתנות רגישות. אנו מתארים פרוטוקול המשלבת בחיי עיר הכלאה immunostaining לגילוי בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר.

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים באתרו של הכלאה

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

פיתחנו שיטה פישוטe לבידוד תאי לב בודדים באיכות גבוהה על ידי טכניקת זלוף antegrade. שיטה זו היא נטולת לנגנדורף ושימושית לבידוד מיוציטים חדריים ופרונליים או תאים ביניים, כגון פיברובלסטים לבביים או אבות.

שיטת זלוף Antegrade לבידוד קרדיומיוציטים מעכברים

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד כמות מספקת של לא-קרדיומיוציטים בודדים עם כדאיות גבוהה מלב עכבר לאחר אוטם שריר הלב (MI). זה יכול לשמש לריצוף תא בודד לאחר מכן, ניתוח ציטומטריית זרימה, ותרבית תאים ראשונית.

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

חקור סינתזת חלבונים דינמית בלב עכבר באמצעות פרופיל פוליזומים. שיטה זו מאפשרת זיהוי mRNA לתרגום, miRNA וחלבוני פוליזום בתגובה ללחץ לבבי.

פרוטיאומיה מבנית ודינמיקה miRNA ניתוח של Polysomes מן הלב העכבר מבודדים לאחר זלוף Langendorff

גלה סרטונים נוספים