Name: 보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 저세포독성 DNA 염료와 FACS를 이용한 성체 마우스 정자세포 및 정자세포아 분리법. 이 방법은 감수분열과 정자형성의 분자 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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네카와, 요시다, 마에자와 연구소 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 원고편집을 위한 케이티 게르하르트; H1T 항체를 공유하기위한 메리 앤 헨델, 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC) NIH S10OD023410에 의해 지원 되는 FACS 장비를 공유 하기 위한 연구 흐름 사이토 메 트리 코어; 과학 연구를 위한 보조금 지원 (KAKENHI; 17K07424) T.N.에; Lalor 재단 박사 후 A.S.에 대한 펠로우십; AMED-CREST (JP17gm110005h00001) - S.Y.; 아자부대학 연구서비스부, 교육부, 문화체육과학기술부(MEXT) 지원 프로그램 (2016~2019), 연구활동 스타트업 보조금 지원(19K21196), 다케다과학재단(2019), 우에하라재단(2019년.M) 건강의 국립 연구소 R01 GM122776 에 S.H.N.

이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침을 따릅니다 (프로토콜 번호. IACUC2018-0040) 신시내티 아동 병원 의료 센터에서.
1. 고환 세포 현탁액의 준비를위한 장비 및 시약 설정
<ol><li>각 효소 육수를 1x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로준비하고 -20°C(표1)에 보관하십시오. 참고: 실험 전에 언제든지 준비합니다.</li>
	<li>실험 하루 전: 하룻밤 4°C에서 태아 소 혈청(FBS)을 가진 튜브 수집 튜브(1.5mL 튜브).</li>
	<li>실험 당일: 수조를 37°C로 설정합니다.</li>
	<li>37°C에서 미리 따뜻한 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)는 15mL 원심분리기 튜브에서 사용하기직전 각 시료에 대해 2mL의 1x 해리 버퍼를 준비한다. 참고: 2mL 해리 버퍼는 두 개의 고환에 대해 준비됩니다. 해리 버퍼 레시피의 경우 표 1을참조하십시오.</li>
</ol>2. 고환 세포 현탁액의 동물 해부 및 준비
<ol><li>8주된 수컷 마우스를 최소 10분 동안 이산화탄소 실에 남겨두어 희생하십시오.</li>
	<li>얼음-차가운 인산염 완충식식염(PBS)이 포함된 60mm 페트리 접시에 고환과 배치를 모두 제거합니다.</li>
	<li>고환에서 튜니카 알부진을 제거합니다. 반열구를 부드럽게 집게로 분리하여 약간 분산시다.</li>
	<li>반열구를 100mm 페트리 접시에 담아 얼음차가운 PBS를 새롭게 한 방울로 옮기고, 반열기구튜벌레를 집게로 부드럽게 풀어보냅니다. 이 세척을 3회 반복하여 간질 세포를 가능한 한 많이 제거합니다.</li>
	<li>37°C에서 2mL의 해리 버퍼를 20분 동안 포함하는 15mL 튜브에서 얽힌 반열구를 배양한다.</li>
	<li>1000 μL 마이크로파이프를 사용하여 튜벌레를 20번 부드럽게 피펫합니다.</li>
	<li>6 분 동안 인큐베이션하십시오. 부드러운 파이펫을 20번 반복합니다.</li>
	<li>3 분 동안 배양하십시오. 보이는 청크가 남아 있지 않을 때까지 부드러운 파이펫팅을 10번 반복합니다.</li>
	<li>서스펜션에 10mL의 FACS 버퍼를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 300 x g의 원심 분리기와 상류부를 폐기하십시오.</li>
	<li>정자와 가능한 한 많은 파편을 제거하기 위해 2.9 단계를 두 번 반복하십시오.</li>
</ol>3. 셀 염색
<ol><li>FACS버퍼(표 1)의3mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고 70 μm 나일론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50mL 튜브로 필터링합니다. 참고: 예상 세포 수율은 2개의 고환 당 대략 1억 개의 세포입니다 (8 주 된 B6 야생 형 마우스에서).</li>
	<li>세포 수를 계산하고 얼룩이 없는 부정적인 대조군으로 세포의 10%를 새로운 튜브로 분할하고 얼음위에 둡니다.</li>
	<li>남은 셀 현탁액에 DCV 얼룩 6 μL(원래 농도는 5mM)을 넣고 잘 섞는다. 최종 농도는 10μM이며 용량은 약 1억 개의 세포입니다.</li>
	<li>어둠 속에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 10분마다 셀 서스펜션을 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
	<li>인큐베이션 후, 세척 단계 없이, 직접 5 μL의 DNase I(육주 농도는 10 mg/mL)를 세포 현탁액에 추가하고 35 μm 나일론 메쉬 캡을 통해 5mL FACS 튜브로 세포를 필터링합니다. 샘플을 정렬할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.</li>
</ol>4. 유동 세포측정및 실험문
<ol><li>FACS 셀 선별기를 준비합니다. FACS 세포 선별기가 흥분 광학 기능이 장착되어 있는지 확인: 바이올렛 (405-nm) 레이저; 감지 광학: 450/50 밴드패스의 필터 조합 [DCV-blue 검출을 위한 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)의 동일한 필터 세트] 및 DCV-레드 감지를 위한 665/30 밴드패스[알로피코시아니안(APC)의 동일한 필터 세트]. 여기에서소니 SH800S 셀 선별기를 예로 들어 보겠습니다.</li>
	<li>새 실험을 만들고 최적화할 매개 변수를 표시하는 다음 작업 플롯을 설정합니다:"워크시트 도구"메뉴 표시줄에"새 밀도"를클릭하여 전방 분산영역(FSC-A) vs. 백 분산 – 영역(BSC-A) 밀도 플롯을 선형 스케일로 만듭니다. "새로운히스토그램"을클릭하여 로그자리믹 스케일에 대한 DCV-blue 히스토그램 플롯을 만듭니다.</li>
	<li>얼룩이 없는 음극제어(3.2단계에서)를 간략하게 소용돌이치며 시료를 적재합니다.</li>
	<li>"시작"및"기록"을클릭하여 스테인처리되지 않은 샘플 처리를 시작합니다. 샘플이 실행되는 동안"검출기 및 임계값 설정"을클릭하여 광증 튜브(PMT) 전압을 위아래로 조정하여 FSC/BSC 플롯의 척도에 스테인드셀을 배치하여 FSC 및 BSC 전압을 최적화합니다.</li>
	<li>샘플이 DCV-블루 히스토그램 로사직플롯(그림 2A)의첫 10년 동안 DCV-음수 집단의 위치를 찾기 위해 실행되는 동안PMT전압을 위아래로 조정합니다. PMT 전압 조정을 완료한 후"중지"를클릭하여 얼룩진 샘플을 언로드합니다.</li>
	<li>샘플을 간략하게 소용돌이 (단계 3.5에서) 샘플을로드합니다.</li>
	<li>"다음튜브"를클릭하여 DCV 염색 된 샘플에 대한 새로운 워크 시트를 만듭니다. DCV 염색 된 샘플을 획득하려면"시작"과"레코드"를클릭하고 1 x 106 이벤트를 ≥ 기록합니다. 다음 작업 플롯 추가:"워크시트 도구"메뉴 막대에"새 밀도"를클릭하여 선형 배율에서 FSC-H(높이) 대 FSC-W(너비) 밀도 플롯을 만듭니다. "새밀도"를클릭하여 선형 축척에서 DCV-blue 대 DCV-적색 밀도 플롯을 만듭니다. 1 x 106 이벤트를 ≥ 녹화한 후"중지"를클릭하고 샘플을 언로드합니다.</li>
	<li>FSC-A 대 BSC-A 밀도 플롯에서"플롯 도구"메뉴 막대에"다각형"을클릭하여 대부분의 세포를 포함하고 작은 파편을 배제합니다(그림2B). 게이트"셀"을FSC-H 대 FSC-W 밀도 플롯에 적용합니다. "사각형"을클릭하여"단일 셀"게이트를 그리면 단일 셀이 아닌 셀(그림2C)을제외합니다.</li>
	<li>"단일셀"게이트를 DCV-블루 대 DCV-적밀도 플롯에 적용하고 도 2D에표시된 확장 된 프로파일을 캡처하는 스케일을 조정합니다. "다각형"을클릭 "플롯 도구" 메뉴 막대는"DCV"게이트를 그리는 것은 스테인드 셀과 측면 모집단을 제외(그림2D).</li>
	<li>"DCV"게이트를 선형 스케일로 DCV-블루 히스토그램 플롯에 적용합니다. 3개의 주요 봉우리들은 1C, 2C 및 4C(그림2E)와같은 다른 DNA 함량을 지칭한다.</li>
	<li>"새로운밀도"를클릭하여 선형 척도에서 DCV-blue 대 DCV-적색 밀도 플롯을 만들고 도 2E에서 다시 게이팅을 수행하여 1C 및 4C 모집단(그림2F)을찾으려는"DCV"게이트를 적용합니다. "타원"을클릭하여 응축 된 영역 (게이트 1C) 내에있는 1C 인구에 게이트를 그립니다. "다각형"을클릭하여 연속 곡선(게이트 4C)인 4C 모집단의 게이트를 그립니다.</li>
	<li>선형 축척에서 DCV-블루 대 DCV-적색 밀도 플롯을 만들고 "4C" 게이트를 적용하려면"새 밀도"를클릭합니다. 확대하여"다각형"을클릭하여 보다 정밀한 선택을 위해 "4C_1" 게이트를그립니다(그림 2G)를확대하여 클릭합니다.</li>
	<li>"새밀도"를클릭하여 선형 축척으로 새로운 FSC-A 대 BSC-A 밀도 플롯을 만들고 "4C_1" 게이트를 적용합니다. 렙토텐(L)/zygotene(Z), 파시텐(P) 및 디플롯텐(D) 정자세포에 해당하는 크기로 분리된 3개의 농축된 인구가 있을 것이다. "다각형"또는"타원"을클릭하여 3 개의 게이트를 그립니다 : "L / Z", "P"및 "D"는 성장하는 크기에 따라(그림 2H).</li>
	<li>"새로운도트 플롯"을클릭하여 선형 스케일에서 DCV-blue 대 DCV-빨간색 도트 플롯을 생성하여 게이트를 적용하고 세 모집단이 "4C_1" 게이트 내에서 연속 순서를 유지하도록 합니다(그림2I).</li>
	<li>마찬가지로, 1C 인구의 경우"새로운 밀도"를클릭하여 선형 척도에 새로운 FSC-A 대 BSC-A 밀도 플롯을 만들고 "1C" 게이트를 적용하고, 순수한 둥근 정자 집단으로 세포의 통합 크기를 선택하고 "타원"을클릭하여"RS" 게이트(그림2J)를그립니다.</li>
</ol>5. 남성 세균 세포 하위 인구 분류
<ol><li>셀 수집을 위해 500 μL 50% FBS가 포함된 1.5mL 튜브를 준비하고 수집튜브를 수집체에 로드하고"로드 컬렉션"을 클릭합니다.</li>
	<li>클릭 "다음 튜브","시작","기록" 및"정렬 시작". 관심있는 두 집단을 수집 장치로 동시에 정렬 할 수있는 양방향 시스템을 사용하려면 L / Z 및 P 백 게이트를 기반으로 렙토텐 (L) / zygotene (Z) 및 pachytene (P) 정자 세포와 같은 쌍별 조합을 따르십시오. 둥근 정자 (RS) 및 디플롯데네 (D) RS와 D 백 게이트에 따라 정자.</li>
	<li>샘플이 실행되는 동안 유량을 ~3000 이벤트/s로 조정하여 가장 효율적인 정렬을 얻습니다.</li>
</ol>6. 정렬 된 세포의 순도 분석
<ol><li>10,000개의 세포/각 집단을 ≥ 수집합니다. 서브 스테이지를 확인하기 위해 세포 면역 염색을 수행합니다.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 300 x g의 원심분리기와 조심스럽게 열판기를 폐기하여 튜브 바닥에 있는 액체의 약 110 μL을 유지합니다.</li>
	<li>현미경으로 관찰하고 개요 세포 형태와 수를 평가하기 위해 세포 현탁액의 10 μL 방울을 가져 가라.</li>
	<li>각 샘플 챔버 슬라이드(재료 표참조)에 셀 서스펜션 100μL을 적용하고 챔버를 Cytospin에 로드합니다.</li>
	<li>실온에서 5 분 동안 30 x g에서 샘플을 회전시. 소수성 펜으로 셀 주위에 원을 그립니다. 실온에서 몇 분 동안 실험실 벤치에 건조 슬라이드.</li>
	<li>슬라이드의 원에 PBS의 50 μL을 드롭하고 탭오프합니다.</li>
	<li>슬라이드의 원에 1 차 항체 용액 (PBS에서 5 % 당나귀 혈청을 0.02 % 폴리소르 바테 20으로 희석)을 슬라이드의 원에 넣고 하룻밤 사이에 4 ° C에서 배양하십시오. 참고: 메이오성 정자 세포의 하위 단계를 판단하기 위해, SYCP3는 DNA 손상 반응의 마커인 메이오성 염색체 축및 γH2AX의 마커인 검출되었다. (항체 작업 농도의경우 재료 표참조)를 참조하십시오.</li>
	<li>슬라이드에서 기본 항체 용액을 탭합니다.</li>
	<li>슬라이드의 원에 PBS의 50 μL을 드롭하고 탭오프합니다. 한 번 반복합니다.</li>
	<li>슬라이드의 원에 이차 항체 용액(PBS에서 이차 항체를 0.02% 폴리소르바테 20으로 희석)하고 어두운 실내 온도에서 1시간 동안 배양한다.</li>
	<li>슬라이드의 원에 PBS의 50 μL을 드롭하고 탭오프합니다. 한 번 반복합니다.</li>
	<li>DAPI의 50 μL을 추가 (재고 농도는 0.1 μg / mL) 5 분 동안 얼룩을 탭.</li>
	<li>슬라이드에 장착 용지 1-2 방울을 추가합니다. 장착 용지를 커버 유리로 조심스럽게 덮고 커버 유리를 부드럽게 눌러 추가 장착 매체와 기포를 제거합니다. 슬라이드는 현미경 평가를 위해 준비됩니다.</li>
</ol>

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<li>Alavattam, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuated+chromatin+compartmentalization+in+meiosis+and+its+maturation+in+sperm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).</li>
<li>Adams, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF8+and+SCML2+cooperate+to+regulate+ubiquitination+and+H3K27+acetylation+for+escape+gene+activation+on+the+sex+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes.</a> PLoS Genetics. 14 (2), 1007233(2018).</li>
<li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+premature+G2%2FM-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).</li>
</ol>

저자는 그들이 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

여기에서 우리는 단일 성인 남성 마우스에서 정자 세포와 정자의 하위 인구를 격리하기 위하여 실용적이고 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 재현성을 보장하기 위해 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 효소 소화 전에, 세척 단계는 간질 세포를 제거하는 것을 목표로; 소화 후,이 단계는 정자와 파편을 제거하는 데 도움이됩니다. 세탁/원심 분리는 3배나 중요합니다. 우리의 해리 완충 레시피에서, 몇몇 다른 효소의 조합은 과도한 세포 손상 없이 단세포 현탁액으로 고환의 해리를 용이하게 합니다. 기포를 일으키지 않도록 부드럽게 파이펫팅하면 세포 무결성을 보호하는 데도 도움이 됩니다. 절개 후 현미경으로 세포 현탁액을 확인하여 현탁액이 단일 세포 수준을 달성했는지 확인하십시오. 과도한 소화로 인한 불완전한 해리 또는 이물질 오염은 정렬된 세포의 순도에 영향을 미칩니다. 그림 S2에표시된 바와 같이, 직립 인구는 정자의 파편과 테트라머를 포함합니다. DCV 염색은 어둠 속에서 인큐베이션이 필...

정자 발생은 정자 줄기 세포의 작은 인구가 성인 생활1,2에걸쳐 많은 수의 정자의 지속적인 생산을 유지하는 복잡한 과정이다. 정자 발생 동안, 동적 크로마틴 리모델링은 정자 세포가 혈전증을 유발하여3, 4,5를생성할 때 일어난다. 메이오혈 정자 세포의 분리는 분자 조사에 필수적이며, 퇴적물 계분리6,7 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)8,9,10,11,12,13,14, 14,16, 16, 16, 16, 16을포함하여 메이오틱 정자 세포를 분리하는 몇 가지 다른접근법이확립되었습니다. 그러나 이러한 방법에는 기술적 한계가 있습니다. 침전계 분리는 다수의세포를5,6,7을산출하지만, 노동집약적이다. 설립된 FACS 기반 방법은 Hoechst 33342(Ho342)를 사용하여 DNA 함량 및 광 산란 특성에 따라 메이오틱 정자세포를 분리하고 자외선(UV) 레이저8,9,10,11을갖춘 FACS 세포 선별기가 필요합니다. 대체 FACS 기반 방법은 생동성 단백질을 발현하는 형질전환 마우스 라인, 정자발생(12)의동기화, 또는 살아있는세포(13)의분리와 호환되지 않는 세포 고정 및 항체 라벨링을 필요로 한다. 세포 투과성 DNA 결합 염료, 염료 자전거 녹색 얼룩14,15,16,17을사용하는 또 다른 대안 방법이 있지만, 이 방법은 청소년 고환으로부터 정자 유발 세포의 분리를 위해 권장된다. 따라서, 모든 연령의 마우스 변형에 적용할 수 있고 어떤 FACS 세포 선별기를 사용하여 수행될 수 있는 살아있는 메이오성 정자 세포에 대한 간단하고 강력한 격리 방법을 개발할 필요가 있다.
여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 이러한 오랫동안 추구 된 세포 격리 프로토콜을 설명합니다. DCV는 호342와 구조적으로 유사하지만 흡개 스펙트럼이 바이올렛범위(18)로이동한 낮은 세포 독성, 세포 투과성 DNA 결합 염료이다. 또한 DCV는 DCG에 비해 광범위한 배기가스 스펙트럼을 가지고 있습니다. 따라서 UV와 바이올렛 레이저가 모두 흥분할 수 있어 장비의 유연성을 향상시켜 UV 레이저가 장착되지 않은 FACS 셀 선별기를 사용할 수 있습니다. 여기에 제시된 DCV 프로토콜은 DCV 블루 및 DCV 빨간색으로 2차원 분리를 사용하여 Ho342 프로토콜의 이점을 모방합니다. 이러한 이점을 통해 DCV 프로토콜을 사용하면 고농축 세균 세포를 성인 고환으로부터 분리할 수 있습니다. 우리는 한 마우스 (두 개의 고환에서) 한 마우스의 성인 마우스 고환에서 살아있는 정자 세포를 격리하기 위하여 상세한 게이팅 프로토콜을 제공합니다. 우리는 또한 이 세포 격리를 위해 사용될 수 있는 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 효율적이고 빠른 프로토콜을 기술합니다. 절차는 완료하는 짧은 시간이 필요합니다 (단일 세포 현탁액의 준비 - 1 시간, 염색 염색 - 30 분 및 셀 정렬 - 2-3 시간 : 필요한 세포의 수에 따라 총 - 4-5 시간; 그림 1). 세포 격리에 따라 RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq 및 세포 배양을 포함한 광범위한 다운스트림 응용 프로그램을 완료할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 튜브</td><td>Watson</td><td>131-7155C</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 페트리 디쉬</td><td>Corning, Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Watson</td><td>1332-015S</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 폴리스티렌 튜브 셀 스트레이너 스냅 캡 (35 &micro; m 나일론 메쉬)</td><td>Corning, Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심 분리기 튜브</td><td>Watson</td><td>1342-050S</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 페트리 접시</td><td>Corning, Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m 나일론 메쉬</td><td>Corning, Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>세포 분류기</td><td>Sony</td><td>SH800S</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 재조합, 동물 유래 무료</td><td>후지 필름 Wako Pure Chemical Corporation</td><td>036-23141</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 1</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Fisher</td><td>12-544-G</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Shandon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td> <td>Fisher</td><td>D1306</td><td>작업 농도 : 0.1 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>시그마</td><td>D5025-150KU</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 세럼</td><td>시그마</td><td>S30-M</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885076</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr>Mary <td>Ann Handel</td><td></td><td>1/2000 희석</td>Hank의<td>Histone H1t 항체</td> 선물</tr><tr><td> s 평형염 용액(HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>소 고환에서 추출한 히알루로니다아제</td><td>Sigma</td><td>H3506-1G</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-4L</td><td></td></tr><tr><td>Pipettemen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Mountant Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>rH2AX 항체</td><td>Millipore</td><td>05-635</td><td>작업 집중도: 2 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>정자 수정 단백질 56 (Sp56) 항체</td><td>QED Bioscience</td><td>55101</td><td>작동 농도: 0.5 &mu; g / mL</td></tr><tr><td>멸균 겸자 및 가위</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost / Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>SYCP3 항체</td><td>Abcam</td><td>ab205846</td><td>작동 농도 : 5 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>TWEEN 20 (폴리소르베이트 20)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DyeCycle 바이올렛 스테인(DCV)</td><td>Invitrogen</td><td>V35003</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

보라색 흥분 세포 투과성 dna 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

메이오성 정자 세포의 격리는 meiosis 및 정자 발생의 근본적인 분자 기계장치를 조사하기 위하여 필수적입니다. Hoechst 33342를 사용하여 세포 격리 프로토콜이 확립되어 있지만 형광 활성화 셀 선별과 함께 염색되지만 자외선 레이저가 장착 된 세포 선별기가 필요합니다. 여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 세포 격리 프로토콜을 설명, 낮은 세포 독성 DNA 결합 염료는 구조적으로 Hoechst 33342와 유사. DCV는 자외선과 보라색 레이저 모두에 의해 흥분 될 수 있으며, 자외선 레이저가 장착되지 않은 셀 선별기를 포함하여 장비 선택의 유연성을 향상시킵니다. 이 프로토콜을 사용하여, 하나는 렙토텐 / zygotene, pachytene 및 디플롯렌 정자 세포뿐만 아니라, 메이오틱 한 후 정자를 포함하여 메이오틱 프PHASE I에서 3 개의 라이브 셀 하위 집단을 격리 할 수 있습니다. 우리는 또한 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 프로토콜을 설명합니다. 전반적으로 이 절차는 완료하는 데 짧은 시간(필요한 셀 수에 따라 4-5시간)이 필요하며, 이는 많은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 합니다.

이 정렬 프로토콜의 대표적인 결과는 그림 3에표시됩니다. 두 고환 (1 마우스)의 총 정렬 시간은 일반적으로 약 3 시간, 셀 서스펜션의 농도 및 선별 속도에 따라 달라집니다. 선별 후, 정자 세포의 순도는 SYCP3 및 γH2AX(도 3A)의면역 염색에 의해 확인된다. 정렬된 L/Z, P, D 정자세포 분획의 대표적인 순도는 각각 약 80.4%, 90.6%, 87.6%이다(그림3C). 이전에19이전에게시한 기준에 따라 하위 스테이지를 결정했습니다. 간략하게, 렙토텐과 zygotene 단계에서, 동종 염색체 사이의 시냅스는 불완전하며, 이는 SYCP3 염색의 얇은 실로 표시됩니다. 광범위한 γH2AX 도메인은 프로그래밍된 DNA 이중 가닥 휴식으로 인해 핵 크로마틴 전체에 걸쳐 관찰된다. 파시텐 단계에서, 동종 염색체는 완전히 ...

여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.

보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...

성인 마우스에서 정자 세포와 정자의 하위 집단을 격리하기위한이 새로운 효율적인 방법은 meiosis 및 정자 발생의 기본 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 현재 사용되는 대부분의 FACS 주문에 적용 할 수있는 넓은 여기 스펙트럼을 가진 낮은 세포 독성 DNA 결합 염료를 사용합니다. 이 방법은 매우 간단합니다.가장 어려운 측면은 유동 세포측정 제비이지만 상세한 게이팅 전략은 프로토콜을 다른 세포 선별기에 적응시키는 데 도움이 되어야 합니다. 이 절차를 시연하는 것은 네카와 사토시 연구소의 연구 조교인 유한 예(Yu-Han Yeh)입니다. 8주 된 수컷 마우스에서 두 고환을 수확한 후, 얼음 차가운 PBS 2밀리리터가 들어있는 60mm 페트리 접시에 티슈를 놓고 튜니카 알부기네아를 제거합니다.고환을 집게로 부드럽게 분리하여 반열구를 약간 분산시합니다. 그리고 100mm 페트리 접시에 신선한 얼음 차가운 PBS 한 방울로 튜블러를 옮춥시다. 집게를 사용하여 튜블을 부드럽게 풀고 방금 입증된 것처럼 PBS의 세 방울로 튜룰을 씻습니다.마지막 세척 후, 15 밀리리터 튜브에 얽힌 반열성 튜블을 넣고 섭씨 37도에서 20 분 배양을 위해 2 밀리리터의 해리 버퍼를 포함합니다. 인큐베이션이 끝나면 1000 마이크로리터 파이펫을 사용하여 튜벌레를 20번 부드럽게 피펫한 후 튜브를 인큐베이터로 6분 더 돌려보냅니다. 인큐베이션이 끝나면 튜브를 인큐베이터로 되돌리기 전에 조직을 20회 추가로 피펫합니다.3분 후, 뚜미가 보이지 않는 조직 조각이 남아 있지 않고 FACS 버퍼 10밀리리터로 해리를 멈추기 전에, 튜블러를 10번 또는 뚜피할 때까지 부드럽게 피펫을 한다. 이어서, 조직 현탁액에 원심분리기는 두 번째 세척을 위한 신선한 FACS 완충제에 대해 10밀리리터를 추가로 사용하여 가능한 한 많은 이물질을 제거한다. 흐름 세포 측정 분석을 위해 세포를 염색하려면 FACS 버퍼의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.그리고 70 미크론 나일론 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 50 밀리리터 튜브로 필터링합니다. 계산 후, 스테인드 네거티브 컨트롤로 얼음에 새로운 튜브로 세포의 10 %를 전송합니다. 그리고 DCV 얼룩의 6 마이크로리터를 나머지 세포 현탁액에 철저히 혼합합니다.어둠 속에서 섭씨 37도에서 30분 간 잠복한 후 10분마다 부드러운 흔들림으로 DNase I의 마이크로리터 5개를 세포에 추가합니다. 그리고 35 미크론 나일론 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 얼음 위에 5 밀리리터 FACS 튜브로 필터링합니다. 셀의 흐름 사이토메트릭 분석을 위해 흐름 분석 소프트웨어에서 새 실험을 만들고 워크시트 도구 메뉴에서 새 밀도를 클릭하여 선형 배율의 백스캐터 영역 밀도 플롯과 비교하여 전방 분산 영역을 만듭니다.새로운 히스토그램을 클릭하여 로그자리믹 스케일에서 DCV 파란색 히스토그램 플롯을 만듭니다. 시작 및 기록을 클릭하여 스테인이없는 샘플 처리를 시작합니다. 샘플이 실행되는 동안 검출기 및 임계값 설정을 클릭하여 전방 및 측면 분산 PMT 전압을 모두 조정하여 스테인드 셀을 앞뒤로 분산된 플롯의 배율에 배치합니다.Jappy 채널의 PMT 전압을 조정하여 DCV 블루 히스토그램 로사스믹 플롯의 첫 10년 동안 DCV 음성 모집단의 위치를 찾습니다. 그런 다음 정지를 클릭하여 얼룩진 샘플을 언로드합니다. 스테인드 샘플을 잠시 소용돌이게 하고 적재한 후 다음 튜브를 클릭하여 샘플에 대한 새 워크시트를 만듭니다.사이토미터를 설정하여 6개의 이벤트에 10회 이상 획득하고 시작 및 기록을 클릭합니다. 다음으로 새 밀도를 클릭하여 앞으로 분산 높이와 전방 분산 폭을 만듭니다. 그리고 선형 축척에서 DCV 파란색 대 DCV 적색 밀도 플롯을 플롯합니다.전방 분산 영역 대 백스캐터 영역 밀도 플롯에서 다각형 도구를 사용하여 셀이라는 게이트를 그리며 대부분의 세포를 포함하고 작은 이물질을 제외합니다. 이 게이트를 전방 분산 높이대 전방 분산 너비 플롯에 적용하고 사각형 도구를 사용하여 단일 셀의 게이트를 그려 단일 셀의 게이트를 그려 단일 셀이 아닌 단일 셀을 제외합니다. 단일 셀의 게이트를 DCV 블루 대 DCV 적밀도 플롯에 적용하고 스케일을 조정하여 확장 된 프로파일을 캡처합니다.다각형 도구를 사용하여 DCV 게이트를 그려 스테인드 셀 및 측면 모집단을 배제하고 선형 스케일의 DCV 파란색 히스토그램 플롯에 게이트를 적용합니다. 3개의 주요 봉우리들은 다른 1C, 2C 및 4C DNA 내용을 지칭합니다. 선형 축척에서 두 번째 DCV 파란색 대 DCV 적색 밀도 플롯을 만듭니다.그리고 다시 게이트 1C및 4C 인구를 찾기 위해 플롯에 DCV 게이트. 선형 축척에서 DCV 빨간색 밀도 플롯과 다른 DCV 파란색을 만듭니다. 그리고 타원 도구를 사용하여 1C 인구에 게이트를 그립니다.다각형 도구를 사용하여 연속 곡선으로 4C 모집단을 게이트합니다. 그리고 선형 축척에서 DCV 적색 밀도 플롯과 다른 DCV 블루를 만듭니다. 다각형 도구를 사용하여 4C 하나의 게이트를 만듭니다.나란히 흩어져 있는 플롯에 의해 새로운 앞으로, 파시텐, 디플롯렌과 렙토텐, zygotene 정자 세포 게이트를 만들기 위해 타원 도구를 사용합니다. 모든 게이트가 그려진 경우 선형 축척으로 새 DCV 파란색 대 DCV 빨간색 도트 플롯을 만들어 4C 게이트에 대한 게이트를 적용하여 세 모집단이 게이트 내에서 연속 순서를 유지할 수 있도록 합니다. 다음으로, 선형 척도에서 백스캐터 영역 밀도 플롯에 비해 새로운 전방 분산 영역을 만들고, 순수한 둥근 정자 집단으로서 세포의 통합 크기를 선택한다.선별 후, 분리된 렙토텐, zygotene, pachytene 및 디플롯렌 정자 분획의 대표적인 순수성은 SYCP3 및 감마 H2AX 면역염색에 의해 확인된 바와 같이 전형적으로 80%에서 90% 사이이다. 둥근 정자 파면의 순도는 Sp56 및 H1t 염색과 함께 DCV와 함께 염색하는 핵에 의해 확인될 수 있으며, 또한 일반적으로 약 90%이며 고립 된 세포 집단의 생존율은 일반적으로 95 %이상이며 단일 성인 마우스로부터각 분수의 평균 총 수율은 일반적으로 다양한 다운스트림 분석에 충분하다. 정렬된 세포는 정자 발생 시 유전자 발현 및 조절을 더 잘 탐구하기 위해 다양한 차세대 염기서열 분석에 사용될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

마우스 testis에서 높은 정화 가능한 meiotic 분수를 얻는 효과적인 방법은 형광 활성 세포 분류 (외과)와 세련된 세포 분리 프로토콜을 결합하는, 설명되어 있습니다. 이 방법은 DNA의 내용과 개별 meiotic 분수의 핵 밀도의 차이 활용합니다.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

효소 세제를 피 설치류 자료에서 고환 세포 현탁액의 기계적 준비를위한 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 방법은 매우 간단하고 빠르고, 재현성 및 흐름 정렬 및 RNA 추출에 적합한 좋은 품질의 세포 현탁액을 렌더링합니다.

고환 세포 현탁액의 준비를 위해 간단하고 효율적인 기술

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환

유세포 분석을 사용하여 마우스 정자에 대한 정렬 전략을 설명합니다. 정자류는 둥글게(정자형성 단계 1-9), 초기신장(정자형성 단계 10-12), 후기신장(정자형성 단계 13-14) 및 길쭉한 정자류(정자형성 단계 15-16)를 포함하여 4개의 매우 순수한 개체군으로 분류됩니다. DNA 염색, 크기 및 입도는 선택 매개변수로 사용됩니다.

단계 별 마우스 정자의 정렬을 유동 세포 계측법에 의해

감수 분열은 gametes DNA 복제의 단일 라운드와 염색체 분리의 두 연속 라운드를 통해 형성 되는 발달 과정입니다. 포유류 감수 분열 meiotic 염색체 스프레드를 준비 하는 기법을 이용 하 여 시험 될 수 있다. 여기, 마우스 spermatocytes에서 표면 확산 핵을 준비 하는 방법을 설명 합니다.

Meiotic 염색체의 준비에서 마우스 Spermatocytes 확산

이 연구는 다른 포유 동물 종의 고환 조직으로부터 정제 된 배아 세포 집단을 얻는 방법의 표준화를 기술한다. Hoechst-33342 및 propidium iodide로 염색하는 기계적 고환 해리와 남성 생식 생물학의 비교 연구에서 폭넓게 응용할 수있는 FACS 분류법을 결합한 간단한 프로토콜입니다.

기계 조직 해리 및 유동 세포 계측법에 의한 포유 동물 수컷 세포의 다중 종 정제에 대한 표준화 된 접근법

여기에 제시된 것은 표준 실험실 장비와 불연속 소 혈청 알부민 밀도 그라데이션을 사용하여 성인 마우스 고환에서 파키틴 정자 세포, 둥근 정자 및 길쭉한 정자를 풍부하게하기위한 프로토콜입니다.

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보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리

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