Name: protein purification with sec and imac
Uploaded: 2023-04-30T06:30:54.000Z
Duration: 7 min 51 s
Channel: JoVE

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Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

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Chromatography-based Biomolecule Purification Methods

chromatographie-basierte biomolekül reinigungsverfahren

In der Biochemie werden Chromatographie-basierte Reinigungsverfahren eingesetzt, um Verbindungen aus einer komplexen Mischung zu isolieren. Zwei solche Methoden, die von Biochemikern allgemein verwendet sind Größe-Ausschluss-Chromatographie und Affinitätschromatographie. Größe-Ausschluss-Chromatographie trennt eine Spalte verpackt mit porösen Korne Bestandteile einer Mischung abhängig von der Größe. Auf der anderen Seite ermöglicht eine genauere Trennung von Biomolekülen Affinitätschromatographie mithilfe einer Spalte, die der stationären Phase besteht die zielspezifischen Liganden enthält.
Dieses Video dient als Einführung in die Größe-Ausgrenzung und Affinitätschromatographie sowie die Konzepte, die sie regieren. Eine schrittweise Anleitung für die Reinigung von einem Histidin-markierten Protein von immobilisierten Metall Affinitätschromatographie wird beschrieben. Anwendungen für beide chromatographischen Methoden der Biochemie und biomedizinischer Forschung werden auch profiliert.
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"Chromatographie" bezieht sich auf eine Vielzahl von Methoden verwendet, um eine Komponente aus einer komplexen Mischung, ein wesentlicher Schritt, bevor ein Biomolekül Eigenschaften und Aktivitäten bestimmt werden können zu isolieren. Jede chromatographische Technik hat einen anderen Mechanismus für die Trennung, abhängig von der Probenmatrix und Zielsubstanz. Dieses Video konzentriert sich auf die Grundsätze und den Betrieb von zwei Methoden üblich, Biochemie: Größe-Ausgrenzung und Affinität Chromatographie.
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<div class="chapter_text" id="script_1">
Größe-Ausschluss-Chromatographie oder SEC basiert auf der Größe der Verbindungen in der Probe. Eine mobile Phase mit der Probe wird hinzugefügt, um eine Spalte mit einem porösen Material: der stationären Phase. Die Moleküle in der Probe fallen in 1 von 3 Kategorien.
Moleküle zu groß, um die Poren zu geben Reisen die kürzeste Verbindung durch die Säule. Jede Spezies mit einem Molekulargewicht über diese "Ausgrenzung Grenze" wird die Spalte gleichzeitig beendet. Moleküle klein genug, um die Poren frei geben am längsten einbehalten werden und werden beendet die Spalte zusammen. Das Molekulargewicht ermöglicht komplette Pore Eintrag ist die "Permeation Grenze".
Nur Moleküle zwischen diesen Grenzen werden voneinander getrennt werden, da sie unterschiedliche Mengen an Zeit diffundieren in die und aus den Poren zu verbringen. Kleinere Moleküle sind mehr auf die Spalte beibehalten, weil sie mehr Zeit in der stationären Phase verbringen, während größere Moleküle innerhalb dieser Grenzen früher beenden.
Molekulargewichte über 1 bis 2 Größenordnungen fallen innerhalb dieser Grenzen. Spalten werden mit diesem im Verstand ausgewählt, oder mehrere Spalten können in Serie verwendet werden, wenn es eine breite Palette von gewünschten Verbindungen gibt.
Nun, da Sie die Theorie der SEC gesehen haben, schauen wir wie es durchgeführt wird.
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Um die SEC-Vorgang zu starten, muss die Spalte mit entionisiertem Wasser und Chromatographie Puffer equilibriert. Nachdem vorbereitet, wird Puffer mit der Probe auf die Säule eingespritzt. Der Puffer wird dann mit einer low-Flow-Rate durch gedrückt. Ein Detektor überwacht, was die Spalte, um das Vorhandensein des gewünschten Analyten bestimmen beendet. Große Moleküle mit Molekulargewichten oberhalb der Ausgrenzung beenden die Spalte zur gleichen Zeit. Kleine Brüche in der Spalte werden in Röhren gesammelt. Jede Fraktion ist für die Qualität des Zielmoleküls durch Gelelektrophorese oder andere analytische Techniken getestet.
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Nun werfen wir einen Blick auf Affinitätschromatographie oder AC, eines der effizientesten Mittel, Proteine zu reinigen. Viele Biomoleküle binden selektiv an bestimmte Liganden-a-Eigenschaft die AC nutzt durch die Einhaltung einer zielspezifischen Liganden an die stationäre Phase.
Wenn das Gemisch durch die Säule fließt, zuordnen Zielmoleküle der Liganden und der Rest Durchströmung. Nachdem die Mischung der Spalte durchlaufen hat, kann das Zielmolekül durch zwei Elution Methoden basierend auf Spezifität gesammelt werden.
Biospezifischen Elution kann man sagen, ein haben eine "Normal" oder "Reverse-Rolle". In Normal-Rolle biospezifischen Elution ist ein Agent hinzugefügt, die mit der eingehalten Liganden binden mit dem Ziel Biomolekül konkurriert.
Im Gegenteil-Rolle biospezifischen Elution konkurriert ein Agent mit dem Ziel, an dem eingehalten Liganden binden. Die zweite Art der Elution, unspezifische Elution, senkt die Ziel-Ligand-Bindung durch eine Änderung der Lösung pH, Ionenstärke oder Polarität. Wenn ein Protein nicht zu einem Liganden bindet, die immobilisiert werden kann, das Protein kann ausgedrückt werden mit einem "Tag": kurze Peptid-Sequenzen entwickelt, um an den Liganden binden.
Eine Sorte ist stillgestellte Metallionen Affinitätschromatographie, "IMAC" kurz, wo eine haftende Metall Liganden, wie Nickel oder Kobalt, Histidin Rückstände auf das veränderte Protein bindet. Durch molekularbiologische Techniken entstehen Zielproteine mit sich wiederholenden Histidin Rückstände, Polyhistidine-Tag genannt, die das Metall über den Imidazol-Seitenkette auf Histidin bindet. Einmal gebunden, das Protein kann mit kostenlosen Imidazol per Reverse-Rolle bestimmte Elution gesammelt werden und später in eine Vielzahl von downstream-Anwendungen verwendet.
Nun, da Sie die Theorie der Affinitätschromatographie gesehen haben, schauen Sie sich bitte an ein IMAC-Verfahren im Labor.
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IMac kann die stationäre Phase direkt auf die Mischung der mobilen Phase und Probe, so dass die Bindung des sein-tagged Proteins hinzugefügt werden. Dieser Brei wird dann in der Spalte "" gegossen wo die nicht gebundenen Tropf zu Abfall, Verbindungen während die Gülle bleibt. Die Gülle-Container wird gespült, sammle restliche Harz und Muster, die die Spalte hinzugefügt wird.
Das Harz wird gerührt, um sicherzustellen, dass die ungebundenen Komponenten frei fließend sind. Hinzugefügt von Waschanlagen Puffer hilft ihnen weg spülen. Sobald alle ungebundenen Bestandteile entfernt wurden, wird die Abfälle mit einem Container zu sammeln, das Zielprotein ersetzt.
Puffer mit Imidazol wird hinzugefügt, gerührt und Ruhe um das Zielmolekül trennen durfte. Die Imidazol bindet an das Metall, ersetzen und die Freigabe der tagged Proteins. Das befreite Protein wird gesammelt und der Imidazol-Schritt wird wiederholt, um die gesamte Kollektion zu gewährleisten. Um die Probe weiter zu reinigen, kann SEC auf die Probe vor der Analyse ausgeführt werden.
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<div class="chapter_text" id="script_5">
Nun, da wir die Theorie und das Verfahren dieser beiden Techniken gesehen haben, betrachten wir einige der Möglichkeiten, wie, die Sie im biochemischen Bereich angewendet werden.
Ein häufiger Grund, Proteine zu reinigen ist, ihre Rolle in der Krankheit zu studieren. Mukoviszidose wird durch Mängel in der Mukoviszidose transmembranen Leitwert Regler Protein oder CFTR verursacht. Nach einem Wachstum des Proteins mit einem his-Tag in der Hefe, ermöglichen Affinität und Größe-Ausschluss Chromatographie die Isolierung des Proteins, gefolgt von der Studie seiner Funktion.
In einigen Fällen kann das Vorhandensein eines Polyhistidine-Tags eine Proteinstruktur und beeinträchtigt dadurch seine Funktion ändern. Eine weitere gemeinsame Tag ist Maltose-bindende Protein oder MBP, die Amylose in einer Spalte gebunden binden wird. Maltose wird dann verwendet, um den Komplex zu lösen. MBP kann dann gespalten und entfernt bei SEC, reine gewünschten Proteins zu produzieren.
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Sie habe nur Jupiters Video-on-Größe-Ausgrenzung und Affinität Chromatographie beobachtet. Es bedeckt die Theorie der Techniken, ging über allgemeine Verfahren und behandelt einige der Anwendungen der Techniken.
Danke fürs Zuschauen!
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Chromatographie-basierte Biomolekül Reinigungsverfahren

In biochemistry, chromatography-based purification methods are employed to isolate compounds from a complex mixture. Two such methods used commonly by ...

"Chromatographie" bezieht sich auf eine breite Palette von Methoden, die verwendet werden, um eine Komponente aus einem komplexen Gemisch zu isolieren, ein wesentlicher Schritt, bevor die Eigenschaften und Aktivitäten eines Biomoleküls bestimmt werden können. Jede chromatographische Technik hat einen anderen Trennmechanismus, abhängig von der Probenmatrix und der Zielverbindung. Dieses Video konzentriert sich auf die Prinzipien und die Funktionsweise von zwei Methoden, die in der Biochemie üblich sind: die Größenausschluss- und die Affinitätschromatographie. Die Größenausschlusschromatographie oder SEC basiert auf der Größe der Verbindungen in der Probe. Eine mobile Phase, die die Probe enthält, wird zu einer Säule mit einem porösen Material gegeben: der stationären Phase. Die Moleküle in der Probe fallen in 1 von 3 Kategorien. Moleküle, die zu groß sind, um in die Poren einzudringen, legen den kürzesten Weg durch die Säule zurück. Jede Spezies, deren Molekulargewicht über dieser "Ausschlussgrenze" liegt, verlässt die Spalte gleichzeitig. Moleküle, die klein genug sind, um ungehindert in die Poren einzudringen, werden am längsten zurückgehalten und verlassen die Säule gemeinsam. Das Molekulargewicht, das einen vollständigen Poreneintritt ermöglicht, ist die "Permeationsgrenze". Nur Moleküle zwischen diesen Grenzen werden voneinander getrennt, da sie unterschiedlich viel Zeit damit verbringen, in die Poren hinein und aus ihnen heraus zu diffundieren. Kleinere Moleküle bleiben länger auf der Säule, weil sie mehr Zeit in der stationären Phase verbringen, während größere Moleküle innerhalb dieser Grenzen früher austreten. Molekulargewichte von 1 bis 2 Größenordnungen liegen innerhalb dieser Grenzen. Die Säulen werden unter diesem Gesichtspunkt ausgewählt, oder es können mehrere Säulen in Reihe verwendet werden, wenn es eine große Bandbreite an gewünschten Verbindungen gibt. Nachdem Sie nun die Theorie der SEC gesehen haben, schauen wir uns an, wie sie durchgeführt wird. Um das SEC-Verfahren zu starten, muss die Säule mit deionisiertem Wasser und Chromatographiepuffer äquilibriert werden. Nach der Vorbereitung wird der Puffer mit der Probe auf die Säule injiziert. Der Puffer wird dann mit einer niedrigen Durchflussrate durchgeschoben. Ein Detektor überwacht, was aus der Säule austritt, um das Vorhandensein des gewünschten Analyten zu bestimmen. Große Moleküle mit Molekulargewichten oberhalb der Ausschlussgrenze verlassen die Säule gleichzeitig. Kleine Fraktionen aus der Kolonne werden in Röhrchen gesammelt. Jede Fraktion wird durch Gelelektrophorese oder andere Analysetechniken auf die Qualität des Zielmoleküls getestet. Werfen wir nun einen Blick auf die Affinitätschromatographie oder AC, eine der effizientesten Methoden zur Aufreinigung von Proteinen. Viele Biomoleküle binden selektiv an bestimmte Liganden – eine Eigenschaft, die sich AC zunutze macht, indem es einen zielspezifischen Liganden an die stationäre Phase bindet. Wenn das Gemisch durch die Säule fließt, binden sich die Zielmoleküle an den Liganden, und der Rest fließt hindurch. Nachdem das Gemisch die Säule durchlaufen hat, kann das Zielmolekül durch eine von zwei Elutionsmethoden basierend auf der Spezifität gesammelt werden. Man kann sagen, dass die biospezifische Elution eine "normale" oder "umgekehrte Rolle" hat. Bei der biospezifischen Elution in normaler Rolle wird ein Wirkstoff hinzugefügt, der mit dem adhärenten Liganden konkurriert, um an das Zielbiomolekül zu binden. Bei der biospezifischen Elution mit umgekehrter Rolle konkurriert ein Wirkstoff mit dem Ziel, um an den angehafteten Liganden zu binden. Die zweite Elutionsart, die "unspezifische" Elution, senkt die Bindung zwischen Ziel und Ligand, indem sie den pH-Wert, die Ionenstärke oder die Polarität der Lösung ändert. Wenn ein Protein nicht an einen Liganden bindet, der immobilisiert werden kann, kann das Protein mit einem "Tag" exprimiert werden: kurze Peptidsequenzen, die so konstruiert sind, dass sie an den Liganden binden. Eine Variante ist die immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie, kurz "IMAC", bei der ein anhaftender Metallligand, wie Nickel oder Kobalt, an Histidinreste auf dem modifizierten Protein bindet. Durch molekularbiologische Techniken werden Zielproteine mit sich wiederholenden Histidinresten erzeugt, die als Polyhistidin-Tag bezeichnet werden und über die Imidazol-Seitenkette auf Histidin an das Metall binden. Einmal gebunden, kann das Protein mit freiem Imidazol über eine Reverse-Role-spezifische Elution gesammelt und später in einer Vielzahl von Downstream-Anwendungen eingesetzt werden. Nachdem Sie nun die Theorie der Affinitätschromatographie kennengelernt haben, schauen wir uns ein IMAC-Verfahren im Labor an. Bei IMAC kann die stationäre Phase direkt zu dem Gemisch aus mobiler Phase und Probe hinzugefügt werden, was die Bindung des his-markierten Proteins ermöglicht. Dieser Schlamm wird dann in die Säule gegossen, wo die ungebundenen Verbindungen in den Abfall tropfen, während der Schlamm verbleibt. Der Güllebehälter wird gespült, um Restharz und Probe aufzufangen, die in die Säule gegeben wird. Das Harz wird gerührt, um sicherzustellen, dass die ungebundenen Komponenten frei fließen. Ein zusätzlicher Waschpuffer hilft, sie wegzuspülen. Sobald alle ungebundenen Bestandteile entfernt wurden, wird der Abfall durch einen Behälter ersetzt, in dem das Zielprotein gesammelt wird. Imidazolhaltiger Puffer wird zugegeben, gerührt und ruhen gelassen, um das Zielmolekül zu lösen. Das Imidazol bindet an das Metall, ersetzt und gibt das markierte Protein wieder frei. Das freigesetzte Protein wird gesammelt, und der Imidazol-Schritt wird wiederholt, um eine vollständige Sammlung sicherzustellen. Um die Probe weiter zu reinigen, kann SEC vor der Analyse auf die Probe angewendet werden. Nachdem wir nun die Theorie und das Verfahren dieser beiden Techniken kennengelernt haben, schauen wir uns einige der Möglichkeiten an, wie sie im biochemischen Bereich angewendet werden. Ein häufiger Grund für die Reinigung von Proteinen ist die Untersuchung ihrer Rolle bei Krankheiten. Mukoviszidose wird durch Defekte im Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulatorprotein (CFTR) verursacht. Nach der Züchtung des Proteins mit einem His-Tag in Hefe ermöglichen sowohl die Affinitäts- als auch die Größenausschlusschromatographie die Isolierung des Proteins, gefolgt von der Untersuchung seiner Funktion. In einigen Fällen kann das Vorhandensein eines Polyhistidin-Tags die Struktur eines Proteins verändern und dadurch seine Funktion beeinträchtigen. Eine weitere häufige Markierung ist das Maltose-bindende Protein oder MBP, das in einer Säule an gebundene Amylose bindet. Maltose wird dann verwendet, um den Komplex freizusetzen. Das MBP kann dann gespalten und mit SEC entfernt werden, um das reine gewünschte Protein herzustellen. Sie haben sich gerade das Video von JoVE über Größenausschluss und Affinitätschromatographie angesehen. Es behandelte die Theorie der Techniken, ging auf allgemeine Verfahren ein und behandelte einige der Anwendungen der Techniken. Danke fürs Zuschauen!

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JoVE Science Education

Chemistry

Chemie

Biochemistry

Biochemie

protein purification with sec and imac

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC.

Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A sample moves through a column packed with porous beads, which make up the stationary phase. Large molecules that cannot enter the pores travel the shortest path and leave first. Smaller molecules enter the pores, spend more time in the column, and leave later. Molecules between the exclusion limit and the permeation limit can be separated from each other, while molecules above or below those limits exit together.

The SEC procedure begins with equilibration of the column using deionized water and chromatography buffer. Sample-containing buffer is then injected, and the liquid is pushed through at a low flow rate. A detector watches what comes out of the column, and fractions are collected in tubes. These fractions can then be checked for the target molecule by gel electrophoresis or other analytical methods.

Affinity chromatography, or AC, uses the fact that many biomolecules bind selectively to certain ligands. In this method, a target-specific ligand is attached to the stationary phase. As the mixture passes through the column, the target binds to the ligand while the rest flows through. The target can then be released by biospecific elution, which may use a competing agent in normal-role or reverse-role form, or by nonspecific elution, which changes pH, ionic strength, or polarity.

If a protein does not naturally bind to an immobilized ligand, it can be engineered with a tag. A common example is a polyhistidine tag, or his-tag. In immobilized metal ion affinity chromatography, nickel or cobalt on the column binds to histidine residues through the imidazole side chain. The tagged protein is then released with free imidazole by reverse-role specific elution and can be used in downstream applications.

The IMAC procedure begins by mixing the stationary phase with the sample so the his-tagged protein can bind. The slurry is poured into the column, and unbound material drains to waste. The resin is rinsed into the column, stirred, and washed to remove leftover unbound components. After that, a container is placed to collect the target protein, and imidazole buffer is added to release it. The imidazole binds the metal, displaces the tagged protein, and the collected step may be repeated to improve recovery. For further cleanup, SEC can be run before analysis.

These purification methods are useful in biochemical and biomedical research. One example is cystic fibrosis research, where the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein, or CFTR, is grown with a his-tag in yeast and then isolated with affinity and size-exclusion chromatography. In some cases, a polyhistidine tag can change protein structure and affect function. Another tag used in protein work is maltose-binding protein, or MBP, which binds amylose in a column and is released with maltose. The MBP can then be cleaved and removed with SEC to produce the desired pure protein.

Protein Purification with SEC and IMAC

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Diese Sammlung enthält häufig verwendete Methoden zur Reinigung, wie z. b. Affinity Chromatographie, sowie analytische Methoden wie MALDI-TOF. Darüber hinaus präsentieren die Videos Methoden zur Beurteilung von Biomolekül Interaktion und Funktion, wie Co-Immunopräzipitation und metabolische Kennzeichnung.

Explore how size-exclusion chromatography and IMAC separate proteins by size or binding, and see how tagged proteins are purified for research.

Protein Purification with SEC and IMAC | JoVE K12

Overview

Size-Exclusion Chromatography

Operation of Size-Exclusion Chromatography

Affinity Chromatography

Operation of Affinity Chromatography

Applications

Summary

What is Photosynthesis?

Photosynthesis is a multipart, biochemical process that occurs in plants as well as in some bacteria. It captures carbon dioxide and solar energy to ...

Light as Energy

The energy required to carry out photosynthesis is light&#8212; typically electromagnetic radiation from the sun. The range of all possible wavelengths is ...

Anatomy of Chloroplasts

Green algae and plants, including green stems and unripe fruit, harbor chloroplasts&mdash;the vital organelles where photosynthesis takes place. In ...

Photosystem II

The multi-protein complex photosystem II (PS II) harvests photons and transfers their energy through its bound pigments to its reaction center, and ...

Photosystem I

Although structurally similar to photosystem II (PSII), photosystem I (PSI) is has a different electron supplier and electron acceptor.
Both these ...

The Calvin Cycle

Overview

Oxygenic photosynthesis converts approximately 200 billion tons of carbon dioxide (CO2) annually to organic compounds and produces approximately ...

C4 Pathway and CAM

Most plants use the C3 pathway for carbon fixation. However, some plants, such as sugar cane, corn, and cacti that grow in hot conditions, use alternative ...

the-z-scheme-of-electron-transport-in-photosynthesis

The Z-Scheme of Electron Transport in Photosynthesis

The light reactions of photosynthesis assume a linear flow of electrons from water to NADP+. During this process, light energy drives the splitting of ...

Photosynthesis

Autotrophs

Almost all living organisms on Earth depend on photosynthesis, which is the process that converts sunlight energy into a simple sugar called ...

Plant Pigment Chromatography and Floating Leaf Discs in a Vacuum
ExpandOn the day before the experiment, fill a container with water.
Place the spinach ...

Plant Pigment Chromatography
ExpandNOTE: In this experiment you will separate pigments from spinach leaves using chromatography paper. Individual pigments ...

First Law of Thermodynamics

The First Law of Thermodynamics states that energy cannot be created or destroyed, only transformed. This can be demonstrated within a classic food web ...

Photosystems

Photosystems are multiprotein complexes that form the functional units of photosynthesis in plants, algae, and cyanobacteria. They are found embedded in ...

An Introduction to Cell Metabolism

In cells, critical molecules are either built by joining together individual units like amino acids or nucleotides, or broken down into smaller ...

Reconstitution of Membrane Proteins

Reconstitution is the process of returning an isolated biomolecule to its original form or function. This is particularly useful for studying membrane ...

Use a model to illustrate how photosynthesis transforms light energy into stored chemical energy.

HS-LS1-5.

Macromolecules

Biomolecules
Organisms contain a wide variety of organic molecules with numerous functions which depend on the chemical structures and properties of these ...

Solution Preparation
ExpandCAUTION: It is important to always use care when handling reagents. For example, iodine will stain clothes and skin so wear ...

Identifying Macromolecules with Indicator Solutions
ExpandHYPOTHESES: In this activity, the experimental hypothesis might be that the addition of an ...

Introduction to Carbohydrates

Carbohydrates, proteins, and fats are the primary macronutrients in the human diet. However, carbohydrates are the most favored source of energy in the ...

Carbohydrate Metabolism

Sugars as Energy Storage Molecules

Chemistry of Carbohydrates

Carbohydrates are an essential part of the diet in humans and animals. Grains, fruits, and vegetables are natural sources of carbohydrates that provide ...

Oligosaccharide Assembly

Protein glycosylation starts in the ER lumen and continues in the Golgi apparatus. Glycosyltransferases catalyze the addition of sugar molecules or ...

What are Lipids?

lipid-derived-compounds-in-the-human-body

Lipid-derived Compounds in the Human Body

Fats and lipids are crucial components in the human body. Some lipid-derived compounds, such as fat-soluble vitamins, eicosanoids, lipoproteins, and ...

Fats as Energy Storage Molecules

Structure of Lipids

Lipids include a diverse group of compounds that are largely nonpolar in nature. This is because they are hydrocarbons that include mostly nonpolar ...

Proteins and Amino Acids

Overview

Proteins are chains of amino acids that are connected by peptide bonds and folded into a 3-dimensional structure. The side chains of individual ...

Amino acids

Amino acids are the monomers that comprise proteins. Each amino acid has the same fundamental structure, which consists of a central carbon atom, or the ...

Peptide Bonds

A peptide bond covalently attaches amino acids through a dehydration reaction. One amino acid&#39;s carboxyl group and another amino acid&#39;s amino ...

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

Conditions on Early Earth

Around 4 billion years ago, oceans began to condense on earth while volcanic eruptions released nitrogen, carbon dioxide, methane, ammonia, and hydrogen ...

ATP and Macromolecule Synthesis

Biological macromolecules are organic compounds, predominantly composed of carbon atoms. The carbon atoms are covalently bonded with hydrogen, oxygen, ...

Dietary Connections

In biological systems, most metabolic pathways are interconnected. The cellular respiration processes that convert glucose to ATP&#8212;such as ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

Overview of Nitrogen Metabolism

Nitrogen is a very important element for life because it is a major constituent of proteins and nucleic acids. It is a macronutrient, and in nature, it is ...

Compounds Essential to Human Function

The human body is composed of cells that are fundamentally made up of several different molecules. These molecules are essential to carry out all ...

an-introduction-to-molecular-developmental-biology

An Introduction to Molecular Developmental Biology

Molecular signals play a major role in the complex processes occurring during embryonic development. These signals regulate activities such as cell ...

Dehydration Synthesis

Dehydration synthesis (also called a condensation reaction) is the chemical process in which two molecules covalently link together to form a new ...

an-introduction-to-saccharomyces-cerevisiae

An Introduction to Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae (commonly known as baker&rsquo;s yeast) is a single-celled eukaryote that is frequently used in scientific research.  S. ...

An Introduction to Transfection

Transfection is the process of inserting genetic material, such as DNA and double stranded RNA, into mammalian cells. The insertion of DNA into a cell ...

All living organisms on Earth are directly or indirectly dependent on photosynthesis. It is the only biological process that can capture energy from ...

an-overview-of-alkenone-biomarker-analysis-for-paleothermometry

An Overview of Alkenone Biomarker Analysis for Paleothermometry

Source: Laboratory of Jeff Salacup&#160;- University of Massachusetts Amherst
Throughout this series of videos, natural samples were extracted and ...

an-introduction-to-caenorhabditis-elegans

An Introduction to Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a microscopic, soil-dwelling roundworm that has been powerfully used as a model organism since the early 1970&rsquo;s.  It was ...

An Overview of Epigenetics

Since the early days of genetics research, scientists have noted certain heritable phenotypic differences that are not due to differences in the ...

An Introduction to Cell Death

Necrosis, apoptosis, and autophagic cell death are all manners in which cells can die, and these mechanisms can be induced by different stimuli, such as ...

An Overview of Gene Expression

Gene expression is the complex process where a cell uses its genetic information to make functional products. This process is regulated at multiple ...

An Introduction to Cell Division

Cell division is the process by which a parent cell divides and gives rise to two or more daughter cells. It is a means of reproduction for single-cell ...

An Overview of Genetic Analysis

An organism&#8217;s physical traits, or phenotype, are a product of its genotype, which is the combination of alleles (gene variants) inherited from its ...

an-introduction-to-cell-motility-and-migration

An Introduction to Cell Motility and Migration

Cell motility and migration play important roles in both normal biology and in disease. On one hand, migration allows cells to generate complex tissues ...

An Overview of Genetic Engineering

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