Name: tracking cell chemistry with metabolic labels
Uploaded: 2023-04-30T06:31:10.000Z
Duration: 8 min 28 s
Channel: JoVE

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New York State Science Learning Standards

High School

Physical Science

HS. Waves and Electromagnetic Radiation

HS-PS4-5.

Metabolic Labeling

metabolische kennzeichnung

Metabolische Kennzeichnung wird verwendet, um die Sonde die biochemischen Veränderungen und Änderungen, die in einer Zelle auftreten. Dies wird erreicht durch den Einsatz von chemischen Analoga, die die Struktur des natürlichen Biomoleküle zu imitieren. Zellen nutzen Analoga in ihrer endogenen biochemischen Prozessen, Herstellung von Verbindungen, die beschriftet werden. Das Label ermöglicht die Einbindung von Erkennung und Affinität-Tags, die dann verwendet werden, um mit anderen biochemischen analytischen Techniken, wie SDS-PAGE und NMR Stoffwechselwege aufzuklären.
Dieses Video stellt die Konzepte der metabolischen Kennzeichnung und zeigen zwei allgemeine Verfahren.  Die erste verwendet Isotopen-Etikettierung, um die Phosphorylierung eines Proteins zu charakterisieren. Die zweite Abdeckungen photoreaktiven Kennzeichnung zur Charakterisierung von Protein-Protein Interaktion innerhalb einer Also drei Anwendungen der metabolischen Kennzeichnung werden vorgestellt: Kennzeichnung Pflanzenmaterial, RNA zur Messung der Kinetik Kennzeichnung und Etikettierung Glykoproteinen bei der Entwicklung von Embryonen.

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Metabolische Kennzeichnung wird verwendet, um die Maschinerie einer Zelle untersuchen. Dies erfolgt mit chemischen Analoga, Sonde, die biochemischen Veränderungen und Änderungen, die auftreten. Dieses Video zeigt die Grundsätze der metabolischen etikettieren, typische Isotopen und photoreaktiven Kennzeichnung Verfahren und einige Anwendungen.
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Metabolische Kennzeichnung kann mit eine Reihe von Strategien durchgeführt werden. Hier beschreiben wir Isotopen, Photoreaktive und Bio-orthogonal zu beschriften.
Isotopen Kennzeichnung erfolgt über strukturelle Analoga, die zu ihren natürlichen Gegenstücken chemisch identisch sind, aber selten Isotope integriert ihre Struktur. In dieser L-Lysin-Analog werden die Kohlenstoff und Stickstoff-Atome durch Kohlenstoff-13 und Stickstoff-15 ersetzt. Zellen in Anwesenheit von Isotopen Analoga kultiviert werden sie in ihrer biochemischen Struktur integrieren. Metaboliten werden aus den Zellen gesammelt und gereinigt für die Analyse. Proben mit stabilen Isotope werden analysiert, mit Techniken wie Massenspektrometrie oder NMR-Spektroskopie. Proben mit radioaktiven Etiketten werden analysiert, mit liquid funkeln zählen und x-ray-Filme, die in der isotopischen Kennzeichnung Protokoll nachgewiesen werden.
Photoreaktive Etiketten sind funktionelle Gruppen integriert Proteine, die stabil bis UV-Licht ausgesetzt sind. Die funktionelle Gruppe bildet eine reaktive Radikale, die das nächste Protein bindet. Ein typisches Beispiel, L-Foto-Leucin, enthält einen Diazirine-Ring, der einem photoreaktiven Vernetzer ist. Im Gegensatz zu den Isotopen zu beschriften, gibt es einige chemische Unähnlichkeit zwischen Foto-reaktive chemische Analoga und ihre natürlichen Pendants. Zellen können über Analoga bevorzugt Naturstoffe enthalten. Daher ist es wichtig, führen Sie Foto-reaktive Kennzeichnung in Medium frei von der Verbindung wird nachgeahmt. Wenn ultraviolette Strahlung ausgesetzt, werden die Foto-reaktiven Gruppen in einem beschrifteten Protein instabil und hochreaktive, wodurch es zu vernetzen mit interagierenden Proteine, erstellen ein Protein Komplex. Vernetzte komplexe wirken wie Momentaufnahmen, die dann mit SDS-PAGE und Massenspektrometrie Methoden analysiert werden können. Dies gibt Einblicke in welche Reaktionen in den Stoffwechselweg durch die Identifizierung Reaktion Arten auftreten und wie sie interagieren durch die Bestimmung Bindungsstellen.
Bioorthogonal-Kennzeichnung-Strategien nutzen Analoga mit kleinen funktionellen Gruppen, die wenig bis gar keine Reaktivität mit natürlichen Biomoleküle zu haben. Azides sind beispielsweise kleine funktionelle Gruppen, deren Reaktivität orthogonal zur biochemischen Reaktionen werden soll. In der Staudinger-Ligatur greift eine Phosphin-Gruppe die Azido-Gruppe. Daraus ergibt sich ein Übergangszustand, der Atropisomerie mit einer nahe gelegenen Ester, was zu einem Amin-gebundenen Liganden reagiert. Bioorthogonal funktionelle Gruppen integriert Biomoleküle können mit Erkennung Tags wie fluoreszierende Funktionsgruppen ligiert und Affinität Stichwörter wie Antigene.
Nun, einige Konzepte und Strategien für die metabolische Bezeichnung diskutiert worden sind, schauen Sie sich bitte an den Prozess im Labor.
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Der erste Schritt in einem metabolischen Kennzeichnung Experiment ist das Protein des Interesses zu sammeln. Zu diesem Zweck werden Zellen auf einem Teller angebaut, und eine Ausdruck-Methode wird verwendet, um die Synthese des gewünschten Proteins zu fördern. In diesem Beispiel Leucin-reiche wiederholen Kinasen oder LRRK ausgedrückt. Binatrium Phosphat, mit radioaktivem Phosphor-32, dient als die analogen. Angemessene Maßnahmen zum Schutz vor ionisierender Strahlung. Dazu gehören ein Arbeitsbereich einrichten, angemessene Schutzausrüstung tragen und auf radioaktive Kontamination überprüft. Sicherheitsmaßnahmen getroffen haben, ist das Medium mit der isotopischen Analoga bereit. Das Medium aus der Kultur ist entfernt und ersetzt mit einem mit der isotopischen chemische Analoga und dann bebrütet. Nach Inkubation sind die Zellen lysiert. Die lysate gesammelt und gereinigt.
Nach der Reinigung werden Proteine aufgelöst, mit SDS-PAGE und dann auf einer PVDF-Membran übertragen. Autoradiographie wird durchgeführt, indem man die Membran um Röntgen-Film und mit einem Phosphor Imager gemessen. Westliche Beflecken wird verwendet, um relative Proteingehalt in der PVDF-Membran zu messen. In diesem Beispiel wiederholen die Phosphorylierung Ebenen der Leucin-reiche Kinasen in 293T synthetisiert, die Zellen gemessen wurden. Die Autoradiogram zeigt wieviel Phosphor wurde in das Protein aufgenommen. Westliche Beflecken, erläutert die Ebenen der LRRK Proteine. Bildanalyse-Software dient zur quantitativen Daten der Phosphorylierung Ebenen der Proteine zu erhalten.
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In diesem nächsten Verfahren zeigt photoreaktiven beschriften. Erstens sind die Zellen vorbereitet und kultiviert. Die photoreaktiven Analog ist hinzugefügt, um die Zellen in der Mitte des Log-Phase und inkubiert. In diesem Verfahren wird p-Benzoylphenylalanine verwendet. Proben werden in Abständen gesammelt und auf Eis gelegt. Die Proben werden dann ausgesetzt, um Schnappschüsse von der biochemischen Bahnen im Laufe der Zeit zu erhalten. Interessierender Proteine werden dann gereinigt und mit SDS-PAGE aufgelöst.
Eine Photoreaktive Kennzeichnung Strategie wurde verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die mit dem Protein des Interesses zu interagieren. Immunodetection mit Western Blot zeigt Protein-Bands, die höheren Molekulargewicht Proteinen anzugeben sind im bestrahlten Proben vorhanden. Diese sind von Vernetzung durch Protein-Protein Wechselwirkung auftritt während der UV-Bestrahlung.
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Nun, da wir metabolische Kennzeichnung Verfahren überprüft haben, betrachten wir einige der Möglichkeiten, die der Prozess verwendet wird.
Metabolische Kennzeichnung Konzepte erweiterbar auf vielzellige Organismen. Pflanzen wachsen in einer geschlossenen Umgebung reich an stabile Isotope, produzierten beschrifteten Pflanzenmaterial. Kohlendioxid mit Kohlenstoff-13 ist das Gehäuse, während Stickstoff-15 hinzugefügt, die reiche Dünger verwendet wird. Das daraus resultierende geerntete Pflanzenmaterial kann Fragen zu Kohlenstoff und Stickstoff aus dem Ökosystem Radsport beantworten helfen.
Kennzeichnung ermöglicht die Trennung der neugebildete RNA von älteren RNS. Durch die Veränderung der Ausgangskonzentration des Analog, kann die Kinetik der neuen RNS-Synthese bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konzentration von 4-Thiouridine beeinflusst, wie viel neue RNA transkribiert wird. Darüber hinaus können Aufnahme Preise des Labels in RNA direkt mit einem Spektrophotometer quantifiziert werden.
Mit Biorthogonal Click-Chemie, können Glykoproteinen in ein Zebrafisch-Embryonen beschriftet werden. Die Eizellen werden mit einer Kennzeichnung Verbindung injiziert, die Ergebnisse in Alkinen Etiketten auf den Glykoproteinen. Glykanen in die Larven werden dann zu einer Farbstoff-Verbindung bei der gewünschten Entwicklung ligiert. Die Glykoproteinen in den Embryonen werden dann abgebildet. Glykane produziert zu unterschiedlichen Zeitpunkten können identifiziert werden, durch Markierung mit unterschiedlichen Farben in den verschiedenen Phasen der Entwicklung des Embryos.
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Sie haben nur Jupiters Video auf metabolische Kennzeichnung angesehen. Dieses Video beschreibt die Konzepte hinter metabolische Kennzeichnung und ihre Strategien, ging über zwei allgemeine Verfahren und fallen einige der Anwendungen von den Techniken.
Danke fürs Zuschauen!
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Metabolische Kennzeichnung

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs ...

Die metabolische Markierung wird verwendet, um die Maschinerie einer Zelle zu untersuchen. Dies wird mit chemischen Analoga erreicht, um die auftretenden biochemischen Umwandlungen und Modifikationen zu untersuchen. Dieses Video zeigt die Prinzipien der metabolischen Markierung, typische isotopische und photoreaktive Markierungsverfahren und einige Anwendungen. Die metabolische Markierung kann mit einer Reihe von Strategien durchgeführt werden. Hier werden wir die isotopische, photoreaktive und bioorthogonale Markierung beschreiben. Die Isotopenmarkierung wird unter Verwendung von strukturellen Analoga durchgeführt, die chemisch identisch mit ihren natürlichen Gegenstücken sind, aber ungewöhnliche Isotope in ihre Struktur integriert haben. In diesem L-Lysin-Analogon werden die Kohlenstoff- und Stickstoffatome durch Kohlenstoff-13 und Stickstoff-15 ersetzt. Zellen, die in Gegenwart von Isotopenanaloga kultiviert werden, bauen diese in ihre biochemischen Strukturen ein. Metaboliten werden aus den Zellen entnommen und für die Analyse gereinigt. Proben mit stabilen Isotopen werden mit Techniken wie Massenspektrometrie oder NMR-Spektroskopie analysiert. Proben mit radioaktiven Markierungen werden mittels Flüssigszintillationszählung und Röntgenfilmen analysiert, was im Isotopenmarkierungsprotokoll demonstriert wird. Photoreaktive Markierungen sind funktionelle Gruppen, die in Proteine eingebaut sind und stabil sind, bis sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden. Die funktionelle Gruppe bildet ein reaktives Radikal, das an das nächstgelegene Protein bindet. Ein gängiges Beispiel, L-Photo-Leucin, enthält einen Diazirinring, der ein photoreaktiver Vernetzer ist. Im Gegensatz zur Isotopenmarkierung gibt es eine gewisse chemische Unähnlichkeit zwischen photoreaktiven chemischen Analoga und ihren natürlichen Gegenstücken. Zellen können natürliche Verbindungen gegenüber Analoga bevorzugen. Daher ist es wichtig, die photoreaktive Markierung in einem Medium durchzuführen, das frei von der zu imitierenden Verbindung ist. Sobald sie ultravioletter Strahlung ausgesetzt sind, werden die photoreaktiven Gruppen in einem markierten Protein instabil und hochreaktiv, wodurch es sich mit interagierenden Proteinen vernetzt und ein Proteinkomplex entsteht. Vernetzte Komplexe fungieren als Momentaufnahmen, die dann mit SDS-PAGE und massenspektrometrischen Methoden analysiert werden können. Dies gibt Aufschluss darüber, welche Reaktionen im Stoffwechselweg ablaufen, indem Reaktionsarten identifiziert werden und wie sie interagieren, indem Bindungsstellen bestimmt werden. Bioorthogonale Markierungsstrategien verwenden Analoga mit kleinen funktionellen Gruppen, die wenig bis gar keine Reaktivität mit natürlichen Biomolekülen aufweisen. Zum Beispiel sind Azide kleine funktionelle Gruppen, deren Reaktivität als orthogonal zu biochemischen Reaktionen bezeichnet wird. Bei der Staudinger-Ligatur greift eine Phosphingruppe die Azidogruppe an. Dadurch entsteht ein Übergangszustand, der intramolekular mit einem nahegelegenen Ester reagiert, was zu einem amingebundenen Liganden führt. Bioorthogonale funktionelle Gruppen, die in Biomoleküle eingebaut sind, können mit Nachweis-Tags wie fluoreszierenden funktionellen Gruppen und Affinitäts-Tags wie Antigenen ligiert werden. Nachdem nun einige Konzepte und Strategien für die metabolische Markierung diskutiert wurden, schauen wir uns den Prozess im Labor an. Der erste Schritt in einem metabolischen Markierungsexperiment besteht darin, das interessierende Protein zu sammeln. Dazu werden Zellen auf einer Platte gezüchtet und eine Expressionsmethode verwendet, um die Synthese des gewünschten Proteins zu fördern. In diesem Beispiel werden leucinreiche Repeatkinasen (LRRK) exprimiert. Als Analogon wird Dinatriumphosphat verwendet, das radioaktiven Phosphor-32 enthält. Zum Schutz vor ionisierender Strahlung müssen geeignete Maßnahmen getroffen werden. Dazu gehören die Einrichtung eines Arbeitsbereichs, das Tragen geeigneter Schutzausrüstung und die Überprüfung auf radioaktive Kontamination. Sobald Sicherheitsmaßnahmen getroffen wurden, wird das Medium, das die Isotopenanaloga enthält, vorbereitet. Das Medium aus der Kultur wird entfernt und durch ein Medium ersetzt, das die isotopischen chemischen Analoga enthält, und dann inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen lysiert. Das Lysat wird aufgefangen und gereinigt. Nach der Aufreinigung werden die Proteine mit SDS-PAGE aufgelöst und anschließend auf eine PVDF-Membran übertragen. Bei der Autoradiographie wird die Membran einem Röntgenfilm ausgesetzt und mit einem Phosphor-Imager gemessen. Western Blot wird verwendet, um den relativen Proteingehalt in der PVDF-Membran zu messen. In diesem Beispiel wurden die Phosphorylierungsniveaus von leucinreichen Repeat-Kinasen gemessen, die in 293T-Zellen synthetisiert wurden. Das Autoradiogramm zeigt, wie viel Phosphor in das Protein eingebaut wurde. Western Blotting klärt die Spiegel der LRRK-Proteine auf. Bildanalysesoftware wird verwendet, um quantitative Daten über den Phosphorylierungsgrad der Proteine zu erhalten. In diesem nächsten Verfahren wird die photoreaktive Markierung demonstriert. Zunächst werden die Zellen präpariert und kultiviert. Das photoreaktive Analogon wird den Zellen in der Mid-Log-Phase zugesetzt und inkubiert. Bei diesem Verfahren wird p-Benzoylphenylalanin verwendet. Die Proben werden in Intervallen entnommen und auf Eis gelegt. Die Proben werden dann exponiert, um Momentaufnahmen der biochemischen Signalwege im Laufe der Zeit zu erhalten. Die interessierenden Proteine werden dann mit SDS-PAGE aufgereinigt und aufgelöst. Eine photoreaktive Markierungsstrategie wurde verwendet, um Verbindungen zu identifizieren, die mit dem interessierenden Protein interagieren. Die Immundetektion mit Western Blotting zeigt Proteinbanden, die darauf hindeuten, dass Proteine mit höherem Molekulargewicht in den bestrahlten Proben vorhanden sind. Diese stammen aus der Vernetzung aufgrund der Protein-Protein-Wechselwirkung, die während der UV-Bestrahlung stattfindet. Nachdem wir nun die Verfahren zur metabolischen Markierung überprüft haben, schauen wir uns einige der Möglichkeiten an, wie der Prozess verwendet wird. Konzepte der metabolischen Markierung können auf mehrzellige Organismen ausgeweitet werden. Die Pflanzen werden in einer geschlossenen Umgebung angebaut, die reich an stabilen Isotopen ist, um markiertes Pflanzenmaterial zu produzieren. Kohlendioxid, das Kohlen-13 enthält, wird dem Gehege zugesetzt, während stickstoff-15-reicher Dünger verwendet wird. Das daraus gewonnene Pflanzenmaterial kann helfen, Fragen zum Kohlenstoff- und Stickstoffkreislauf aus dem Ökosystem zu beantworten. Die Markierung ermöglicht die Trennung von neu synthetisierter RNA von älterer RNA. Durch Änderung der Anfangskonzentration des Analogons kann die Kinetik der neuen RNA-Synthese bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konzentration von 4-Thiouriidin beeinflusst, wie viel neue RNA transkribiert wird. Zusätzlich können die Einbauraten der Markierung in RNA direkt mit einem Spektralphotometer quantifiziert werden. Mit Hilfe der biorthogonalen Click-Chemie können Glykane in einem Zebrafischembryo markiert werden. Den Eiern wird eine Markierungsverbindung injiziert, die zu Alkinmarkierungen auf den Glykanen führt. Die Glykane in den Larven werden dann im gewünschten Entwicklungsstadium zu einer Farbstoffverbindung ligiert. Anschließend werden die Glykane in den Embryonen abgebildet. Glykane, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten produziert werden, können durch Markierung mit unterschiedlichen Farben in verschiedenen Stadien der Embryonalentwicklung identifiziert werden. Sie haben sich gerade das Video von JoVE über die metabolische Markierung angesehen. Dieses Video beschreibt die Konzepte hinter der metabolischen Markierung und ihre Strategien, geht auf zwei allgemeine Verfahren ein und behandelt einige der Anwendungen der Techniken. Danke fürs Zuschauen!

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Biochemistry

Biochemie

tracking cell chemistry with metabolic labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways.

Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an L-lysine analog. Photoreactive labeling uses groups that stay stable until they are exposed to ultraviolet light. Bioorthogonal labeling uses small functional groups, such as azides, that do not normally react with other biomolecules.

Isotopic labels are added to cultured cells, and the cells build them into their proteins and metabolites. The collected samples are purified and then analyzed by mass spectrometry or NMR spectroscopy when stable isotopes are used. When radioactive labels are used, liquid scintillation counting and x-ray film are used for detection. The protocol shown uses radioactive phosphorus-32 to study phosphorylation of leucine-rich repeat kinases, or LRRK, in 293T cells.

Proper safety steps are needed when working with radioactive material. The work area must be set up carefully, protective equipment must be worn, and the samples must be checked for contamination. After incubation with the labeled medium, the cells are lysed, the lysate is collected, and the proteins are purified. The proteins are then separated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, and detected by autoradiography and Western blotting. Image analysis software is used to quantify phosphorylation levels.

Photoreactive labeling is used to capture protein-protein interactions. In this method, p-benzoylphenylalanine is added to cells during mid-log growth, and samples are collected over time and kept on ice. After UV exposure, the photoreactive group becomes highly reactive and cross-links with nearby proteins. The cross-linked complexes are then purified, run on SDS-PAGE, and examined by Western blotting. Higher molecular weight bands in irradiated samples show that cross-linking has occurred.

Bioorthogonal labeling uses reactions that are separate from normal cell chemistry. In the Staudinger ligation, a phosphine reacts with an azido group and forms a labeled product that can carry detection or affinity tags. This approach is useful for adding fluorescent tags or antigen tags to biomolecules without strongly disturbing their natural behavior.

The same labeling ideas can also be applied to plants, RNA, and embryos. Plants grown in a sealed environment can be labeled with carbon-13 carbon dioxide and nitrogen-15 fertilizer to study carbon and nitrogen cycling. New RNA can be separated from older RNA to measure synthesis kinetics, and the amount of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. In zebrafish embryos, glycans can be labeled by click chemistry, dyed at different developmental stages, and imaged in different colors to track when they are made.

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

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dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Diese Sammlung enthält häufig verwendete Methoden zur Reinigung, wie z. b. Affinity Chromatographie, sowie analytische Methoden wie MALDI-TOF. Darüber hinaus präsentieren die Videos Methoden zur Beurteilung von Biomolekül Interaktion und Funktion, wie Co-Immunopräzipitation und metabolische Kennzeichnung.

Learn how metabolic labels help trace protein changes, protein interactions, RNA synthesis, plant growth, and glycan development in cells and embryos.

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels | JoVE K12

Life Science

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

HS-LS2-4.

Overview

Principles of Metabolic Labeling

Isotopic Labeling Procedure

Photoreactive Labeling Procedure

Applications

Summary

Travelling Waves

A wave is a disturbance that propagates from its source, repeating itself periodically, and is typically associated with simple harmonic motion. ...

Wave Parameters

The simplest mechanical waves are associated with simple harmonic motion and repeat themselves for several cycles. These simple harmonic waves can be ...

Equations of Wave Motion

Mathematically, the motion of a wave can be studied using a wavefunction. Consider a string oscillating up and down in simple harmonic motion, having a ...

Graphing the Wave Function

Consider the wave equation for a sinusoidal wave moving in the positive x-direction. The wave equation is a function of both position and time. From the ...

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Velocity and Acceleration of a Wave

A wave propagates through a medium with a constant speed, known as a wave velocity. It is different from the speed of the particles of the medium, which ...

Speed of a Transverse Wave

The speed of a wave depends on the characteristics of the medium. For example, in the case of a guitar, the strings vibrate to produce the sound. The ...

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Problem-Solving: Tuning of a Guitar String

In the case of stringed instruments like the guitar, the elastic property that determines the speed of the sound produced is its linear mass density or ...

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Kinetic and Potential Energy of a Wave

All forms of waves carry energy; this is directly visualized in nature. For instance, the waves of earthquakes are so intense that they can shake huge ...

Energy and Power of a Wave

The total energy associated with a wavelength is the sum of the potential energy and the kinetic energy. The average rate of energy transfer associated ...

Interference and Superposition of Waves

When two waves of the same nature occur in the same region simultaneously, they result in interference. Interference of waves implies that the net effect ...

Reflection of Waves

When a wave travels from one medium to another, it gets reflected at the boundary of the second medium. A common example of this is when a person yells at ...

Propagation of Waves

When a wave propagates from one medium to another, part of it may get reflected in the first medium, and part of it may get transmitted to the second ...

Standing Waves

Sometimes waves do not seem to move; rather, they just vibrate in place. Unmoving waves can be seen on the surface of a glass of milk kept in a ...

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Modes of Standing Waves - I

A close look at earthquakes provides evidence for the conditions appropriate for resonance, standing waves, and constructive and destructive interference. ...

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Modes of Standing Waves: II

The starting point for expressing the modes of standing waves is understanding the boundary conditions that the waves must follow. The boundary conditions ...

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Sound Waves

Sound waves can be thought of as fluctuations in the pressure of a medium through which they propagate. Since the pressure also makes the medium&#39;s ...

Sound as Pressure Waves

Sound waves, which are longitudinal waves, can be modeled as the displacement amplitude varying as a function of the spatial and temporal coordinates. As ...

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Perception of Sound Waves

The human ear is not equally sensitive to all frequencies in the audible range. It may perceive sound waves with the same pressure but different ...

Speed of Sound in Solids and Liquids

Most solids and liquids are incompressible&#8212;their densities remain constant throughout. In the presence of an external force, the molecules tend to ...

Speed of Sound in Gases

The speed of sound in a gaseous medium depends on various factors. Since gases constitute molecules that are free to move, they are highly compressible. ...

Shock Waves

While deriving the Doppler formula for the observed frequency of a sound wave, it is assumed that the speed of sound in the medium is greater than the ...

Echo

The human ear cannot distinguish between two sources of sound if they happen to reach within a specific time interval, typically 0.1 seconds apart. More ...

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Use mathematical representations to support a claim regarding relationships among the period, frequency, wavelength, and speed of waves traveling and transferring energy (amplitude, frequency) in various media.

HS-PS4-1.

Using GIS to Investigate Urban Forestry

Source: Laboratories of Margaret Workman and Kimberly Frye - Depaul University
Urban forests broadly include urban parks, street trees, landscaped ...

Evaluate questions about the advantages of using a digital transmission and storage of information.

HS-PS4-2.

concept-of-resonance-and-its-characteristics

Concept of Resonance and its Characteristics

If a driven oscillator needs to resonate at a specific frequency, then very light damping is required. An example of light damping includes playing piano ...

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Sound Waves: Resonance

Resonance is produced depending on the boundary conditions imposed on a wave. Resonance can be produced in a string under tension with symmetrical ...

Sound Waves: Interference

Sound waves can be modeled either as longitudinal waves, wherein the molecules of the medium oscillate around an equilibrium position, or as pressure ...

Interference: Path Lengths

Consider two sources of sound, that may or may not be in phase, emitting waves at a single frequency, and consider the frequencies to be the same.
Two ...

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The Wave Nature of Light

The nature of light has been a subject of inquiry since antiquity. In the seventeenth century, Isaac Newton performed experiments with lenses and prisms ...

The Electromagnetic Spectrum

The electromagnetic spectrum consists of all the types of electromagnetic radiation arranged according to their frequency and wavelength. Each of the ...

The Quantum-Mechanical Model of an Atom

Shortly after de Broglie published his ideas that the electron in a hydrogen atom could be better thought of as being a circular standing wave instead of ...

Quantum Numbers

It is said that the energy of an electron in an atom is quantized; that is, it can be equal only to certain specific values and can jump from one energy ...

Interference and Diffraction

Source: Yong P. Chen, PhD, Department of Physics &#38; Astronomy, College of Science, Purdue University, West Lafayette, IN
Interference and diffraction ...

Photoelectric Effect

Source: Yong P. Chen, PhD, Department of Physics &#38;&#38; Astronomy, College of Science, Purdue University, West Lafayette, IN
Photoelectric effect ...

Reflection and Refraction

Source: Derek Wilson,&#160;Asantha Cooray, PhD, Department of Physics &#38; Astronomy, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, CA
...

Evaluate the claims, evidence, and reasoning behind the idea that electromagnetic radiation can be described either by a wave model or a particle model (quantum theory), and that for some situations one model is more useful than the other.

HS-PS4-3.

Electric Charge in a Magnetic Field

Source: Andrew Duffy, PhD, Department of Physics, Boston University, Boston, MA
This experiment duplicates J.J. Thomson's famous experiment at the end of ...

Electromagnetic Fields

Electric fields generated by static charges, often referred to as electrostatic fields, are characteristically different from electric fields created by ...

Electromagnetic Waves

James Clerk Maxwell formulated a single theory combining all the electric and magnetic effects scientists knew during that time, calling the phenomena his ...

Electromagnetic waves are categorized according to their wavelengths and frequencies, giving the electromagnetic spectrum. These waves are classified as ...

Plane Electromagnetic Waves I

The existence of combined electric and magnetic fields that propagate through space as electromagnetic (EM) waves is the most significant prediction of ...

Plane Electromagnetic Waves II

Consider a plane wavefront traveling in position x-direction with a constant speed. This wavefront can be utilized to obtain the relationship between ...

propagation-speed-of-electromagnetic-waves

Propagation Speed of Electromagnetic Waves

Electromagnetic waves are consistent with Ampere&#39;s law. Assuming there is no conduction current Ampere&#39;s law is given as:


Consider a plane ...

Electromagnetic Waves in Matter

Electromagnetic waves can travel in the vacuum as well as in matter. For example light, which is an electromagnetic wave, can travel through air, water, ...

Energy Carried By Electromagnetic Waves

Anyone who has used a microwave oven knows there is energy in electromagnetic waves. Sometimes, this energy is obvious, such as in the summer sun&#39;s ...

Intensity Of Electromagnetic Waves

The energy transport per unit area per unit time, or the Poynting vector, gives the energy flux of an electromagnetic wave at any specific time. For a ...

Momentum And Radiation Pressure

An object absorbing an electromagnetic wave would experience a force in the direction of propagation of the wave. This force occurs because ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging

Source: Frederick W. Damen and Craig J. Goergen, Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, West Lafayette, Indiana
In this video, high ...

an-introduction-to-drosophila-melanogaster

An Introduction to Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster, also known as the fruit fly, is a powerful model organism widely used in biological research that has made significant ...

an-introduction-to-the-zebrafish-danio-rerio

An Introduction to the Zebrafish: Danio rerio

Zebrafish (Danio rerio) are small freshwater fish that are used as model organisms for biomedical research. The many strengths of these fish include their ...

Evaluate the validity and reliability of claims in published materials of the effects that different frequencies of electromagnetic radiation have when absorbed by matter.

HS-PS4-4.

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

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