Name: membrane proteins in liposome models
Uploaded: 2023-04-30T06:31:34.000Z
Duration: 7 min 5 s
Channel: JoVE

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HS-LS1-3.

Reconstitution of Membrane Proteins

rekonstitution von membranproteinen

Rekonstitution ist der Prozess der Rückkehr eines isolierten Biomolekül in seiner ursprünglichen Form oder Funktion. Dies ist besonders nützlich für die Untersuchung der Membranproteine, die ermöglichen wichtige Zellfunktionen und beeinflussen das Verhalten des nahe gelegenen Lipide. Um die Funktion des gereinigten Membranproteine an Ort und Stelle zu studieren, müssen sie wieder hergestellt durch eine künstliche Lipidmembran einzugliedern.
Dieses Video stellt Membrane Protein Rekonstitution Konzepte und Verfahren, wie Protein isoliert mit Reinigungsmittel, Bildung von künstliche Vesikel mit Lipiden, Einbeziehung des isolierten Proteins in die künstliche Vesikel und Trennung des Waschmittels aus der Lösung. Zu guter Letzt zwei Anwendungen abgedeckt werden: Wiederherstellung des Membran-Transportproteine und Rekonstitution des Licht-ernten Proteine.
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Rekonstitution ist der Prozess der Wiederherstellung einer isolierten Biomolekül zu seiner ursprünglichen Form oder Funktionalität. Dieser Ansatz wird häufig verwendet, wenn Membranproteine, die viele wichtige zelluläre Prozesse ermöglichen und beeinflussen das Verhalten des benachbarten Lipide zu studieren. Die Komplexität der Zelle Umgebung erschwert jedoch Membran Proteinfunktionen zu studieren in-situ. Die Proteine können extrahiert und gereinigt, aber ihre eigentlichen Funktionen nicht ohne eine Membran ausgewertet werden. Deshalb sind isolierte Membranproteine durch Integration in eine künstliche Lipidmembran, z. B. ein Liposom rekonstituiert . Dieses Video führt die Grundsätze der Membrane Protein Rekonstitution, eine allgemeine Rekonstitution und einige Anwendungen in der Biochemie.
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Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden und Membranproteine. Die Phospholipide bilden eine Bilayer, in dem die hydrophilen Phosphat-Köpfe mit wässrigen innen und außen der Zelle, interagieren, während die hydrophoben Fettsäure-Tails in der Bilayer miteinander interagieren.
Manche Membranproteine interagieren nur mit der Membran durch elektrostatische oder Nichtkovalente Wechselwirkungen. Andere, genannt "integrale Proteine", sind in der Lipid-Bilayer eingebettet.
Wie der Bilayer integrale Proteine haben hydrophilen enden und eine hydrophobe Zentrum und durch hydrophobe Wechselwirkungen in Position gehalten werden. Integrale Proteine, die die gesamte Membran erstrecken sind bekannt als "transmembranen Proteine".
Die Wechselwirkungen zwischen dieser Proteine und die Membran sind so stark, dass sogar lyse der Zellen nicht trennen wird. Ein spezieller Tensid genannt ein Waschmittel wird verwendet, um die Proteine zu extrahieren. Ähnlich wie Phospholipide, Reinigungsmittel haben hydrophilen Köpfe und lipophilen Endstücke und können die Membran frei eingeben.
Innerhalb der Membran interagieren die lipophilen Endstücke des Waschmittels mit den hydrophoben Protein-Kern. Dies umschließt das Protein mit einer Schale der hydrophilen Waschmittel Köpfe, die die Protein-Lipid-Wechselwirkungen stört.
Der Protein-Reinigungsmittel-Komplex ist jetzt leicht von der Membran getrennt. Das Waschmittel macht den Komplex löslich in wässrigen Lösungen und bereit für die Wiederherstellung in eine künstliche Membran.
Proteine werden häufig in den Membranen der Liposomen, die künstliche Vesikel sind wiederhergestellt. Um Liposomen vorzubereiten, sind getrocknete Lipide hydratisiert und aufgeregt, um Vesikel Bildung zu induzieren. Wenn ein Spülmittel hinzugefügt wird, ist es die Membranen der Liposomen integriert.
Um das Protein wieder zusammenzusetzen, solubilisiert Proteine und Liposomen kombiniert, und dann das Waschmittel aus Lösung durch Dialyse oder chemische Adsorption entfernt. Die Proteine Liposomen schnell montieren und in Proteoliposomes, also nur die hydrophilen Gruppen ausgesetzt sind. Die Proteine funktionieren dann wie sie in einer Zellmembran und isoliert untersucht werden können.
Jetzt, wo wir die Grundlagen des Proteins Rekonstitution behandelt haben, gehen Sie wir über ein Protokoll für Neuaufbau Membranproteine in Liposomen.
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Um zu beginnen, die Membranproteine zu isolieren, sind die Zellen lysiert. Ungebrochene Zellen werden mit Zentrifugation entfernt.
Der Überstand wird mit einer höheren Geschwindigkeit zu die Membranen Pellets zentrifugiert. Die Kugel ist wieder ausgesetzt und eine Reinigungsmittel wird hinzugefügt, um die Proteine zu extrahieren.
Die restlichen Zellenrückstand wird durch zusätzliche Zentrifugation entfernt. Das Protein ist von der Überstand mit Säulenchromatographie gereinigt und dann konzentriert oder weiter nach Bedarf gereinigt.
Um mit den Vorbereitungen der Liposomen, ist eine Suspension von Phospholipiden in organischen Lösungsmittel unter Stickstoff oder Argon getrocknet.
Die Phospholipide sind hydratisiert mit Hydratation Puffer, und die Mischung ist beschallt, um die Erstellung der Liposomen abzuschließen.
Waschmittel wird hinzugefügt, die Liposomen solubilisieren die ist dann mit den Proteinen kombiniert.
Das Reinigungsmittel wird durch Adsorption auf Polystyrol-Kügelchen, Dialyse oder eine Waschmittel-Bindung Spalte entfernt. Die sich daraus ergebenden Proteoliposomes sind bereit, gereinigt und in späteren Experimenten verwendet werden.
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Nun, da Sie mit den Grundlagen von einer Membran-Protein-Rekonstitution vertraut sind, schauen Sie sich bitte an ein paar Anwendungen von Protein Rekonstitution in Biochemie.
Membrane Transportprotein war wieder hergestellt, um ein klareres Verständnis für seine Transportmechanismus zu gewinnen. Ihrer Funktion nach Rekonstitution wurde mit einem Ausfluss von Iodid-Ionen verifiziert. Dann wurde die Transportaktivität in Anwesenheit von verschiedenen niedermolekulare Ionen-Kanal-Hemmer und Potentiatoren untersucht. Auf diese Weise konnte der direkten Interaktionen dieser kleinen Moleküle mit dem Transportprotein untersucht werden.
Chlorophyll und Carotinoid-bindende Membranproteine in Pflanzen ernten Licht, Förderung der Ladungstrennung und leichte Schäden zu mildern. Durch diese Licht-ernten Proteine Neuaufbau, können ihre Faltung Dynamik und Interaktion mit Pigmenten studiert werden. Die Licht-ernten Proteine rekonstituiert mit dieser Technik hatte sehr ähnliche optische Eigenschaften, die native Proteine. Fluoreszenz-Emission-Spektroskopie kann dann zur Energieübertragung von Pigmenten in die rekonstituierte Licht-ernten Proteine zu studieren.
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Sie haben nur Jupiters Video auf Wiederherstellung von Membranproteinen angesehen. Rekonstitution ist eine Möglichkeit, wichtige Proteine in einer Zelle Mimik zur weiteren Untersuchung übertragen. Dieses Video behandelt die Grundsätze der Protein Rekonstitution, eine Rekonstitution Protokoll und ein paar Anwendungen in der Biochemie. Danke fürs Zuschauen!
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Rekonstitution von Membranproteinen

Reconstitution is the process of returning an isolated biomolecule to its original form or function. This is particularly useful for studying membrane ...

Unter Rekonstitution versteht man den Prozess der Wiederherstellung der ursprünglichen Form oder Funktionalität eines isolierten Biomoleküls. Dieser Ansatz wird häufig bei der Untersuchung von Membranproteinen verwendet, die viele wichtige zelluläre Prozesse ermöglichen und das Verhalten benachbarter Lipide beeinflussen. Die Komplexität der Zellumgebung macht es jedoch schwierig, die Funktionen von Membranproteinen in situ zu untersuchen. Die Proteine können extrahiert und gereinigt werden, aber ihre tatsächlichen Funktionen können ohne Membran nicht bewertet werden. Daher werden isolierte Membranproteine durch Integration in eine künstliche Lipidmembran, wie z.B. ein Liposom, "rekonstituiert". In diesem Video werden die Prinzipien der Rekonstitution von Membranproteinen, ein allgemeines Rekonstitutionsverfahren und einige Anwendungen in der Biochemie vorgestellt. Zellmembranen bestehen hauptsächlich aus Phospholipiden und Membranproteinen. Die Phospholipide bilden eine Doppelschicht, in der die hydrophilen Phosphatköpfe mit dem wässrigen Inneren und Äußeren der Zelle interagieren, während die hydrophoben Fettsäureschwänze in der Doppelschicht miteinander interagieren. Einige Membranproteine interagieren nur durch elektrostatische oder nichtkovalente Wechselwirkungen mit der Membran. Andere, sogenannte "integrale Proteine", sind in die Lipiddoppelschicht eingebettet. Wie die Doppelschicht haben integrale Proteine hydrophile Enden und ein hydrophobes Zentrum und werden durch hydrophobe Wechselwirkungen an Ort und Stelle gehalten. Integrale Proteine, die sich über die gesamte Membran erstrecken, werden als "Transmembranproteine" bezeichnet. Die Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen und der Membran sind so stark, dass sie selbst durch Lysieren nicht voneinander getrennt werden. Ein spezielles Tensid, das sogenannte Detergens, wird verwendet, um die Proteine zu extrahieren. Ähnlich wie Phospholipide haben Detergenzien hydrophile Köpfe und lipophile Schwänze und können frei in die Membran eindringen. Im Inneren der Membran interagieren die lipophilen Schwänze des Detergens mit dem hydrophoben Proteinkern. Dieser umgibt das Protein mit einer Hülle aus den hydrophilen Waschmittelköpfen, wodurch die Protein-Lipid-Wechselwirkungen gestört werden. Der Protein-Detergens-Komplex lässt sich nun leicht von der Membran trennen. Das Detergens macht den Komplex in wässrigen Lösungen löslich und bereit für die Rekonstitution in einer künstlichen Membran. Proteine werden oft in den Membranen von Liposomen, bei denen es sich um künstliche Vesikel handelt, rekonstituiert. Zur Herstellung von Liposomen werden getrocknete Lipide hydratisiert und gerührt, um die Vesikelbildung zu induzieren. Wenn ein Reinigungsmittel zugesetzt wird, wird es in die Liposomenmembranen eingebaut. Um das Protein zu rekonstituieren, werden die gelösten Proteine und Liposomen kombiniert, und dann wird das Detergens durch Dialyse oder chemische Adsorption aus der Lösung entfernt. Die Proteine und Liposomen lagern sich schnell zu Proteoliposomen zusammen, so dass nur die hydrophilen Gruppen freigelegt werden. Die Proteine funktionieren dann wie in einer Zellmembran und können isoliert untersucht werden. Nachdem wir nun die Grundlagen der Proteinrekonstitution behandelt haben, gehen wir ein Protokoll für die Rekonstitution von Membranproteinen in Liposomen durch. Um mit der Isolierung der Membranproteine zu beginnen, werden die Zellen lysiert. Unbeschädigte Zellen werden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wird mit einer höheren Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Membranen zu pelletieren. Das Pellet wird wieder suspendiert und ein Reinigungsmittel wird hinzugefügt, um die Proteine zu extrahieren. Die verbleibenden Zelltrümmer werden durch zusätzliche Zentrifugation entfernt. Das Protein wird mit Hilfe der Säulenchromatographie aus dem Überstand aufgereinigt und dann bei Bedarf konzentriert oder weiter gereinigt. Um mit der Vorbereitung der Liposomen zu beginnen, wird eine Suspension von Phospholipiden in einem organischen Lösungsmittel unter Stickstoff oder Argon getrocknet. Die Phospholipide werden mit Hydratationspuffer hydratisiert und die Mischung wird beschallt, um die Bildung der Liposomen abzuschließen. Um die Liposomen zu lösen, wird Waschmittel hinzugefügt, das dann mit den Proteinen kombiniert wird. Das Detergens wird dann durch Adsorption an Polystyrolkügelchen, Dialyse oder eine Detergenzbindesäule entfernt. Die resultierenden Proteoliposomen sind bereit, gereinigt und in nachfolgenden Experimenten verwendet zu werden. Nachdem Sie nun mit den Grundlagen eines Rekonstitutionsverfahrens für Membranproteine vertraut sind, schauen wir uns einige Anwendungen der Proteinrekonstitution in der Biochemie an. Ein Membrantransportprotein wurde rekonstituiert, um ein besseres Verständnis seines Transportmechanismus zu erlangen. Seine Funktion nach der Rekonstitution wurde mit einem Ausfluss von Iodid-Ionen nachgewiesen. Anschließend wurde die Transportaktivität in Gegenwart verschiedener niedermolekularer Ionenkanalinhibitoren und Potentiatoren untersucht. Auf diese Weise konnten die direkten Wechselwirkungen dieser kleinen Moleküle mit dem Transportprotein untersucht werden. Chlorophyll und Carotinoid-bindende Membranproteine in Pflanzen ernten Licht, fördern die Ladungstrennung und mildern Lichtschäden. Durch die Rekonstitution dieser lichtsammelnden Proteine können ihre Faltungsdynamik und ihre Wechselwirkung mit Pigmenten untersucht werden. Die mit dieser Technik rekonstituierten lichtsammelnden Proteine hatten sehr ähnliche optische Eigenschaften wie die nativen Proteine. Die Fluoreszenzemissionsspektroskopie kann dann verwendet werden, um den Energietransfer von Pigmenten zu den rekonstituierten Lichtsammelproteinen zu untersuchen. Sie haben gerade das Video von JoVE über die Rekonstitution von Membranproteinen gesehen. Die Rekonstitution ist eine Möglichkeit, wichtige Proteine für weitere Untersuchungen auf eine Zellnachahmung zu übertragen. Dieses Video behandelte die Prinzipien der Proteinrekonstitution, ein Rekonstitutionsprotokoll und einige Anwendungen in der Biochemie. Danke fürs Zuschauen!

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membrane proteins in liposome models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane.

Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane proteins attach by noncovalent or electrostatic interactions, while integral proteins are embedded in the bilayer. Transmembrane proteins are integral proteins that span the full membrane, and their strong interactions with the membrane are not broken just by lysing cells.

Detergent is used to extract these proteins. Detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, so they can enter the membrane. Their tails interact with the hydrophobic protein core and surround it with detergent heads, which breaks protein-lipid interactions. The protein-detergent complex becomes soluble in water and is ready for reconstitution.

Liposomes are artificial vesicles often used for this step. They are made by hydrating dried lipids and agitating them to form vesicles. When detergent is added, it becomes part of the liposome membrane. The purified protein and liposomes are then mixed, and the detergent is removed by dialysis or chemical adsorption. As the detergent leaves, the protein and lipids assemble into proteoliposomes, with hydrophilic groups exposed to water. The reconstituted proteins can then work in a membrane-like setting and be studied in isolation.

A general liposome protocol starts with cell lysis. Unbroken cells are removed by centrifugation, and the membranes are pelleted at higher speed. The pellet is resuspended, detergent is added to extract the proteins, and more centrifugation removes leftover debris. The protein is then purified by column chromatography and concentrated if needed.

Liposome preparation follows a separate path. Phospholipids in organic solvent are dried under nitrogen or argon, then hydrated with buffer. Sonication finishes the liposome formation. After detergent is added to solubilize the liposomes, the proteins are combined with them. The detergent is removed with polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column, leaving proteoliposomes that can be purified and used in later experiments.

Reconstituted membrane proteins have several uses in biochemistry. One transport protein was reconstituted to better understand how it moves molecules. Its activity was checked by the efflux of iodide ions. Researchers also tested small-molecule ion channel inhibitors and potentiators to study how they interact with the transport protein directly.

Plant light-harvesting proteins are another example. These chlorophyll- and carotenoid-binding membrane proteins help harvest light, support charge separation, and reduce light damage. After reconstitution, scientists can study folding dynamics and pigment interactions. The reconstituted proteins showed optical properties very similar to native proteins, and fluorescence emission spectroscopy can be used to follow energy transfer from pigments to the proteins.

Membrane Proteins in Liposome Models

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

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Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

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chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

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See how membrane proteins are extracted with detergent and reinserted into liposomes so students can study transport and light-harvesting function.

Membrane Proteins in Liposome Models | JoVE K12

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Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-5.

HS-LS1-6.

Overview

Principles of Membrane Protein Reconstitution

Protocol for Reconstitution of Membrane Proteins in Liposomes

Applications

Summary

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

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Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells.

HS-LS1-1.

Membrane Proteins in Liposome Models

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