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Abstract

Quelle: Collins, S. M., et al., Größenausschlusschromatographie zur Analyse der Heterogenität der bakteriellen Vesikel der äußeren Membran. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video demonstrieren wir eine Technik – Größenausschlusschromatographie – um eine heterogene Population von äußeren Membranvesikeln oder OMVs zu trennen, die von Bakterien abstammen. Diese Vesikel sind kugelförmige Strukturen in Nanogröße und werden durch Size Exclusion Chromatography in große und kleine Subpopulationen unterteilt, die auf ihrer Größe basieren.

Protocol

1. Vorbereitung von Puffern

1. Zur Herstellung des ELISA-Waschpuffers fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 1 l deionisiertem (DI) Wasser hinzu. 500 μl Polysorbat-20 zugeben. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein.
2. Um den Blockierungspuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 10 g BSA hinzu. 500 μl Polysorbat-20 auf 1 l VE-Wasser geben. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein.
3. Zur Herstellung des Elutionspuffers (PBS) fügen Sie 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na₂HPO₄ und 0,24 g KH₂PO₄ bis 1 L DI Wasser hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH.
   auf 7,4 ein Anmerkung: Eine 10-fache Lösung dieses Puffers kann hergestellt und bei Bedarf mit DI-Wasser verdünnt werden.

2. Vorbereitung der OMV Probe

1. Züchten Sie A. actinomycetemcomitans-Zellen bis zur spätexponentiellen Phase (optische Dichte bei 600 nm von 0,7). Pelletieren Sie die Zellen durch zweimaliges Zentrifugieren bei 10.000 x g bei 4 °C für 10 min. Den Überstand durch einen 0,45 μm Filter filtrieren.
2. Konzentrieren Sie den bakterienfreien Überstand mit Dichtfiltern mit einem Molekulargewicht von 50 kDa. Die konzentrierte Lösung bei 105.000 x g bei 4 °C für 30 min ultrazentrifugieren.
3. Das Pellet in PBS resuspendieren und erneut ultrazentrifugieren (105.000 x g bei 4 °C für 30 min.) Resuspendieren Sie das Pellet in 2 mL PBS.

3. Packen der S-1000-Spalte

1. Mischen Sie die Vorratsflasche mit dem Gelfiltrationsmedium mit einem Glasrührstab und gießen Sie das zum Befüllen der Säule erforderliche Volumen zuzüglich ca. 50 % Überschuss (ca. 135 ml) in eine Glasflasche. Lassen Sie diese Kügelchen ruhen, bis sie sich abgesetzt haben, und dekantieren Sie dann die überschüssige Flüssigkeit. Resuspendieren Sie die Kügelchen in Elutionspuffer, so dass die endgültige Lösung etwa 70 % (nach Volumen) Gel und 30 % Puffer enthält. Entgasen Sie die Lösung unter Vakuum.
2. Montieren Sie die Glassäule vertikal mit einem Ringständer und füllen Sie sie mit Elutionspuffer, um die Wände der Säule zu benetzen. Lassen Sie den Puffer ab, bis nur noch etwa 1 cm Puffer in der Spalte übrig ist.
3. Ohne Blasen zu bilden, pipettieren Sie vorsichtig die Perlen in die Säule und füllen Sie die Säule bis zum Rand. Fahren Sie während des gesamten Vorgangs mit dem Ablassen des überschüssigen Puffers fort. Achten Sie darauf, dass sich die Perlen nicht vollständig absetzen, bevor Sie oben in der Säule weitere Perlen anbringen. Die Säule sollte bis zu einer Höhe von ca. 2 cm unter dem Boden des Säulenbehälters gepackt werden.

4. Laden der Probe und Sammeln von Fraktionen

1. Entgasen Sie den Elutionspuffer unter Vakuum. Waschen Sie die Säule mit zwei Säulenvolumina (180 ml) Elutionspuffer.
2. Warten Sie, bis der verbleibende Puffer vollständig in die Spalte gelangt. Sobald der Puffer die Oberseite der Gelschicht erreicht hat, pipettieren Sie vorsichtig eine 2-ml-Probe mit OMVs (bei einer Lipidkonzentration von ca. 100 – 200 nmol/L) auf die Oberfläche der Kügelchen, wobei Sie darauf achten müssen, keine der Kügelchen am oberen Ende der Säule zu beschädigen. Lassen Sie die Probe vollständig in das Gel eindringen, d. h. wenn keine Flüssigkeit über der Gelschicht verbleibt.
3. Geben Sie vorsichtig und langsam Elutionspuffer auf die Gelsäule. Stören Sie nicht die oberste Schicht des Gels, da dies zu einer Verdünnung der Probe führt.
4. Legen Sie ein einzelnes 50-ml-Röhrchen unter die Säule und öffnen Sie die Säule. Entnehmen Sie die ersten 20 ml des Eluenten. Fügen Sie bei Bedarf vorsichtig zusätzlichen Elutionspuffer an der Oberseite der Säule hinzu, um sicherzustellen, dass die Säule nie trocken ist.
5. Legen Sie eine Reihe von 1,5-ml-Röhrchen unter die Säule. Starten Sie die Säule und entnehmen Sie eine Reihe von 1-ml-Proben in jedem Röhrchen. Während der Probenentnahme fügen Sie bei Bedarf weiteren Elutionspuffer am oberen Rand der Säule hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis 96 Fraktionen gesammelt wurden. Stoppen Sie die Spalte.
   Anmerkung: Die Proben sollten bis zur weiteren Analyse bei -20 °C für die Langzeitlagerung oder 4 °C für die kurzfristige Lagerung gelagert werden.
6. Um die Säule zu reinigen, führen Sie ein Säulenvolumen (90 ml) mit 0,1 M NaOH durch die Säule. Führen Sie zwei Säulenvolumina (180 ml) Elutionspuffer durch die Säule.

Materials

Amicon 50 kDa filters	Millipore Sigma	UFC905024
FM 4-64	Thermo Scientific	T13320	1.5 x 50 cm
Glass Econo-Column	BioRad	7371552
Potassium Chloride (KCl)	Amresco (VWR)	0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)	Amresco (VWR)	0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfine	GE Healthcare	17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Chemical	S271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Amresco (VWR)	0404-500G
Tris Base	VWR	0497-1KG