Polyacrylamid-Gelelektrophorese: Eine analytische Technik zum Nachweis von Heparansulfaten unterschiedlicher Kettenlängen, die aus Lungengewebe von Mäusen isoliert wurden
Published: April 30, 2023
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Abstract
Quelle: LaRiviere, W. B. et al., Nachweis von Glykosaminoglykanen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung. J. Vis. Exp. (2021)
Dieses Video zeigt das Trennverfahren von Heparansulfaten, die aus Lungengewebe von Mäusen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert wurden.
Protocol
<p class="jove_title">1. Polyacrylamid-Gelelektrophorese von isolierten und gereinigten Glykosaminoglykanen
- Bereiten Sie die für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) erforderlichen Lösungen im Voraus vor (Tabelle 1).
Anmerkung: Wählen Sie den prozentualen Anteil des Acrylamids der auflösenden Gellösung in Abhängigkeit von der Größe der Glykosaminoglykane, die in der Probe erwartet werden. 15 % werden für die Auflösung größerer Fragmente (mehr als 30 Disaccharid-Untereinheiten Länge) empfohlen; 22 % für kleinere Fragmente (<20 Disaccharid-Untereinheiten lang). - Setzen Sie die leere Kassette in den PAGE-Tank ein. Gießen Sie das auflösende Gel wie folgt: Mischen Sie in einem 15-ml-Röhrchen 10 mL Lösungslösung, 60 μl 10 % Ammoniumpersulfat (muss frisch zubereitet werden) und 10 μl TEMED (fügen Sie TEMED zuletzt hinzu). Drehen Sie das Rohr vorsichtig 2-3x um. Verwenden Sie eine Pipette, um die oben genannte 10-ml-Lösung schnell in die Kassette zu geben. Mit 2 mL deionisiertem, gefiltertem Wasser überlagern und das auflösende Gel 30 Minuten lang polymerisieren lassen
Anmerkung: Das folgende PAGE-Protokoll wurde für ein vertikales PAGE-System optimiert, das 13,3 x 8,7 cm (Breite x Länge) und 1,0 mm dicke Gießkassetten mit einem Gesamtvolumen von ca. 12 ml verwendet. Andere Kassettensysteme können verwendet werden, erfordern jedoch möglicherweise eine Optimierung durch den Endbenutzer. - Nachdem das Auflösungsgel vollständig polymerisiert ist, entsorgen Sie das überlagerte Wasser und gießen Sie das Stapelgel wie folgt: Mischen Sie in einem 15-ml-Röhrchen 3 mL der Stapelgellösung, 90 μl 10% Ammoniumpersulfat (muss frisch zubereitet werden), 3 μl TEMED (fügen Sie TEMED zuletzt hinzu).
- Drehen Sie das Rohr vorsichtig 2-3x um. Verwenden Sie eine Pipette, um die Stapelgellösung schnell über das verfestigte Auflösungsgel zu geben. Kassette bis zum Rand füllen. Vollständig einsetzen Kamm, der im Lieferumfang des Setups enthalten ist. Lassen Sie das Stapelgel 30 min polymerisieren.
- Sobald das Gel polymerisiert ist, stellen Sie sicher, dass der Klebebandstreifen von der Unterseite der Kassette entfernt wird, und setzen Sie die Kassette wieder in die PAGE-Tankbaugruppe ein.
- Füllen Sie die obere und untere Kammer mit dem Puffer der oberen bzw. unteren Kammer.
- Die getrockneten Proben aus Schritt 1.11.4 werden in dem minimal erforderlichen Volumen an entionisiertem, gefiltertem Wasser (höchstens 50 % des Volumens der Vertiefungen im PAGE-Gel) gelöst. 1:1 mit Probenladepuffer mischen. Laden Sie die Proben und die HS-Oligosaccharid-“Leitern” (siehe Tabelle 1) in das Gel.
- Lassen Sie das Gel 5 Minuten lang bei 100 V vorlaufen. Lassen Sie das Gel dann 20-25 min lang bei 200 V laufen (für ein 15%iges Polyacrylamid-Lösungsgel), 40-50 min (für ein 18%iges Polyacrylamid-Lösungsgel), 90-100 min (für ein 22%iges Polyacrylamid-Lösungsgel).
Anmerkung: Möglicherweise ist eine Optimierung der 200 V Laufzeit erforderlich. Phenolrot wandert vor Heparin-Oligosacchariden, die 2 Polymeruntereinheiten lang sind (d. h. Polymerisationsgrad 2 oder dp2); Bromphenolblau wandert vor DP10-DP14. Die besten Ergebnisse werden erzielt, wenn die Spannung so angelegt wird, dass die phenolrote Bande fast, aber nicht ganz, an den Boden des Gels wandert. Passen Sie die Laufzeit entsprechend an.
Representative Results
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Ammonium persulfate (solid) | ThermoFisher Scientific | BP179-25 | Electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | ThermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | ThermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | Any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| EDTA disodium salt (solid) | ThermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glycine (solid) | ThermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Hydrochloric acid (liquid) | ThermoFisher Scientific | A466-250 | |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | ThermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | ThermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Sucrose (solid) | ThermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | ThermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | ThermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | ThermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
| Acrylamide (solid) | ThermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | Galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | Galen scientific | HO20 |
Cite This Article
Polyacrylamide Gel Electrophoresis: An Analytical Technique to Detect Heparan Sulfates of Varying Chain Lengths Isolated from Mouse Lung Tissue. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e21106, doi: (2025).