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Abstract

Quelle: Konovalova, S. Analyse von mitochondrialen Atmungskettenkomplexen in kultivierten menschlichen Zellen mittels blauer nativer Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Immunoblotting. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video demonstrieren wir eine elektrophoretische Technik, genannt blue native PAGE, zur Analyse von mitochondrialen respiratorischen Proteinkomplexen in ihrem nativ gefalteten und funktionell aktiven Zustand. Der anionische Farbstoff Coomassie-Blau bewirkt, dass die Proteinkomplexe negativ geladen werden, was eine Trennung nach Größe und Struktur ermöglicht.

Protocol

<p class="jove_title">1. Herstellung von Puffern und Lösungen

HINWEIS: Alle im Protokoll verwendeten Puffer und Lösungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die gegebenen Volumina der Puffer reichen aus, um 10 Proben vorzubereiten und durchzuführen. Alle Puffer können bis zu einem Jahr bei +4 °C gelagert werden.

1. Bereiten Sie 20 mL 3x Gelpuffer mit 1,5 M Aminocapronsäure, 150 mM Bis-tris in destilliertem Wasser (dH₂O) vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein.
2. Bereiten Sie 10 ml 2 M Aminocapronsäure in dH₂O vor.
3. Bereiten Sie 1 ml des mitochondrialen Puffers vor, indem Sie Folgendes kombinieren: 0,5 ml 3x Gelpuffer, 0,5 ml 2 M Aminocapronsäure und 4 μl 500 mM EDTA.
4. Bereiten Sie 1.000 mL Kathodenpuffer vor, der 15 mM Bis-tris und 50 mM Tricin in dH₂°C enthält. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein.
   1. Bereiten Sie 200 ml blauen Kathodenpuffer vor, indem Sie 0,04 g Coomassie blau G-250 zu 200 ml Kathodenpuffer hinzufügen.
5. Bereiten Sie 1.000 mL Anodenpuffer mit 50 mM Bis-tris in dH₂O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 ein.
6. Bereiten Sie 2,5 ml Probenpuffer vor, der 750 mM Aminocapronsäure und 5 % Coomassieblau G-250 in dH₂O enthält.

2. Herstellung von mitochondrialen Lysaten

1. Plattieren Sie die Zellen am Tag vor der Entnahme. Für HEK293- oder 143B-Zellen verwenden Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % L-Glutamin, 100 mg/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin. Züchten Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei +37 °C in einer mit 5 % CO₂ befeuchteten Atmosphäre. Stellen Sie sicher, dass am Tag der Entnahme mindestens 500.000 Zellen für jede Probe vorhanden sind.
2. Waschen Sie die Zellen einmal vorsichtig mit eiskaltem PBS. Vermeiden Sie es, die Zellen von der Platte zu lösen. Die Zellen abkratzen und bei 800 x g für 10 min bei +4 °C pelletieren.
3. Waschen Sie das Küvettenpellet zweimal mit eiskaltem PBS und zentrifugieren Sie es wie in Schritt 2.2. Messen Sie die Proteinkonzentration mit der Bradford-Methode unter Verwendung eines handelsüblichen Kits. Pelletieren Sie die Zellen bei 800 x g für 10 min bei +4 °C.
   Anmerkung: Führen Sie nach der Zellentnahme alle Schritte bei +4 °C durch und wirbeln Sie nicht vortexen.
4. Bereiten Sie 20 ml PBS mit Proteaseinhibitor vor, indem Sie 200 μl 100x Proteaseinhibitor zu 20 mL PBS hinzufügen. Bleiben Sie auf Eis. Resuspendieren Sie die Zellen in PBS mit einem Proteasehemmer auf eine endgültige Proteinkonzentration von 5 mg/ml.
   1. Um das Volumen von PBS mit Proteaseinhibitor zu berechnen, das zur Resuspendierung der Zellen bei 5 mg/ml erforderlich ist, berechnen Sie die Proteinmenge in jeder Probe. Für diese Berechnung werden die in Schritt 2.3 gemessene Proteinkonzentration und das PBS-Volumen verwendet, mit dem die Zellen nach dem Waschen in Schritt 2.3 resuspendiert wurden.
5. Bereiten Sie 1 ml 3,3 mM Digitonin in PBS mit Proteaseinhibitor vor. Fügen Sie 3,3 mM Digitonin zu einer Endkonzentration von 1,65 mM hinzu. Gut mischen und 5 min auf Eis inkubieren.
   1. Zur Herstellung von 1 ml 3,3 mM Digitonin in PBS mit Proteaseinhibitor lösen Sie 4 mg Digitonin in 1 ml PBS bei 100 °C, bis kein Niederschlag mehr sichtbar ist, und kühlen Sie sofort auf Eis ab. 10 μl 100x Proteaseinhibitor zu 1 ml Digitoninlösung geben.
      Anmerkung: Verwenden Sie nur eine frische Lösung von digitonin.
      Vorsicht: Digitonin ist giftig! Verwenden Sie eine Gesichtsmaske, Handschuhe und einen Laborkittel.
6. Geben Sie PBS mit Proteinase-Inhibitor (hergestellt in Schritt 2.4) bis zum Endvolumen von 1,5 ml. Bei 10.000 x g für 10 min bei +4 °C zentrifugieren. Den Überstand entfernen. In diesem Schritt werden die Mitochondrien pelletiert.
7. Resuspendieren Sie das mitochondriale Pellet in mitochondrialem Puffer. Das Volumen des mitochondrialen Puffers ist halb so groß wie das Volumen von PBS in Schritt 2.4.
8. Frisches 10%iges Laurylmaltosid in PBS mit Proteaseinhibitor (hergestellt in Schritt 2.4) zubereiten. 1 ml ist ausreichend für 10 Proben. Fügen Sie 10% Laurylmaltosid bis zur Endkonzentration von 1% hinzu. Inkubieren Sie 15 Minuten lang auf Eis (dieser Schritt kann bis zu ein paar Stunden dauern).
Bei
9. 20.000 x g für 20 min bei +4 °C zentrifugieren. Den Überstand in ein neues Röhrchen auffangen. Messen Sie die Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode mit einem Kit. Geben Sie Probenpuffer zu, ein Volumen, das halb so groß ist wie das Volumen von Laurylmaltosid, das in Schritt 2.8 verwendet wurde. Die Proben können bis zu 6 Monate bei -80 °C gelagert werden.

<p class="jove_title">3. Vorbereitung des Gradientengels für BN-PAGE

1. Gießen Sie das Farbverlaufsgel für BN-PAGE bei Raumtemperatur auf. Stellen Sie den Gradientenbereiter auf eine Rührplatte und verbinden Sie ihn mit einem flexiblen Schlauch mit der Schlauchpumpe. Befestigen Sie ein Infusionsset mit der Nadel an den Schlauch. Platzieren Sie einen Magnetrührer in der proximalen Kammer des Gradientenmachers. Waschen Sie den Schlauch mit dH₂O bei maximaler Pumpendrehzahl für 10 min.
2. Entleeren Sie den Schlauch und den Gradient Maker. Entfernen Sie mit einer Pipette alle Reste dH₂O im Kanal zwischen den Kammern des Gradientenmachers. Verschließen Sie den Kanal und den Schlauch mit dem Ventil.
3. Montieren Sie mit einem Gussrahmen und Klammern zwei Glasplatten in der Halterung, die an der Unterseite ein Loch hat, und legen Sie sie auf den Ständer. Achten Sie darauf, dass es mehr oder weniger auf einer geraden Fläche mit einem Wasserhaushalt steht. Platzieren Sie die mit dem Schlauch verbundene Nadel zwischen den Glasplatten.
4. Bereiten Sie 6%ige und 15%ige Gellösungen vor (Tabelle 2). Bleiben Sie auf Eis. Fügen Sie zuletzt Ammoniumpersulfat (APS) und Tetramethylendiamin (TEMED) hinzu (sie beginnen mit der Polymerisation). Vorsichtig mischen, um Luftblasen zu vermeiden.
5. Befüllen Sie das proximale Ende der Schlauchkammer des Gradienten-Gel-Mischers mit 6 % Gel und das distale Ende mit 15 % Gel. Das Gesamtvolumen des Gels sollte gleich dem Volumen des Trenngels zwischen den Glasplatten sein. Verwenden Sie also 2,6 ml 6%iges Gel und 2,1 ml 15%iges Gel für den Gradientengelmischer für ein 8,3 cm x 7,3 cm großes Gel.
6. Schalten Sie den Magnetrührer ein und öffnen Sie die Schläuche und den Kanal zwischen den Kammern des Gradientenmachers. Schalten Sie die Peristaltikpumpe sofort auf 5 mL/min ein. Füllen Sie die Glasplatten und lassen Sie keine Blasen in das Gel eindringen. Entfernen Sie die Nadel, wenn sich kein Gel im Schlauch befindet.
7. Überlagern Sie das Gel vorsichtig mit dH₂O. Halten Sie das Gel für die Polymerisation mindestens 1 h bei Raumtemperatur.
8. Waschen Sie den Schlauch unmittelbar nach dem Eingießen des Gels, indem Sie die Gradientenkammern mit dH₂O füllen und die Schlauchpumpe mit maximaler Drehzahl verwenden. Bei der Zubereitung von zwei und mehr Gelen das System immer zwischendurch reinigen.
9. Bereiten Sie 1x Gelpuffer vor, indem Sie 3 mL 3x Gelpuffer mischen und 6 mL dH₂O hinzufügen. Entfernen Sie dH₂O vorsichtig mit Filterpapier von der Oberfläche des Gels. Waschen Sie die Oberfläche des Gels mit 1x Gelpuffer. 1x Gelpuffer mit Filterpapier vorsichtig entfernen.
   1. Vermeiden Sie Fasern aus dem Filterpapier auf dem Gel. Um dies zu gewährleisten, schneiden Sie das Papier mit einer Schere in kleine Stücke, aber zerreißen Sie das Papier nicht.
10. Legen Sie den Kamm zwischen die Glasplatten, tauchen Sie ihn jedoch nicht vollständig ein, um das Stapelgel unter den Kamm gießen zu können. Bereiten Sie das 4%ige Stapelgel vor (Tabelle 2). Fügen Sie zuletzt APS und TEMED hinzu, da sie leicht mit der Polymerisation beginnen. Vorsichtig mischen und dabei Luftblasen vermeiden.
11. Überlagern Sie das Stapelgel, vermeiden Sie Blasen unter dem Kamm und tauchen Sie den Kamm vollständig ein. Lassen Sie das Stapelgel mindestens 30 min polymerisieren. Entfernen Sie den Kamm und waschen Sie die Vertiefungen mit 1x Gelpuffer mit einer Pipette.
    1. Nach der Polymerisation kann das Gel einige Tage bei +4 °C gelagert werden. Um das Gel aufzubewahren, wickeln Sie das Gel in Papier ein, das mit dH₂O und Plastikfolie getränkt ist, um ein Austrocknen des Gels zu verhindern.

<p class="jove_title">4. Blaue native Gelelektrophorese

HINWEIS: Um den Abbau von OXPHOS-Komplexen zu verhindern, führen Sie die Elektrophorese bei +4 °C durch. Verwenden Sie vorgekühlte Puffer.

1. Laden Sie die Gelkassette mit dem blauen Kathodenpuffer bis zum Boden der Vertiefungen. Das Laden der Proben ist einfacher, wenn die Kassette nicht bis zum Rand gefüllt ist. Waschen Sie die Vertiefungen mit dem blauen Kathodenpuffer und füllen Sie die Vertiefungen dann mit der Pipette mit dem blauen Kathodenpuffer.
2. Laden Sie die Proben (5-30 μg Protein) in die Vertiefungen. Füllen Sie die Gelkassette vorsichtig bis zum Rand mit dem blauen Kathodenpuffer und den Tank mit Anodenpuffer.
3. Lassen Sie das Gel 15 Minuten lang bei einer konstanten Spannung von 40 V laufen. Erhöhen Sie dann die Spannung auf 80 V (oder verwenden Sie einen konstanten Strom von 6 mA), überschreiten Sie nicht 10 mA. Lassen Sie das Gel laufen, bis der Farbstoff 2/3 der Gellänge erreicht hat.
4. Ersetzen Sie den blauen Kathodenpuffer durch einen Kathodenpuffer und setzen Sie die Elektrophorese fort, bis die Farbstofffront aufgebraucht ist. Insgesamt dauert die Elektrophorese ca. 3 Stunden.
5. Entnehmen Sie die Glasplatten und übertragen Sie die Proteine durch Semi-Dry-Blotting auf die Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran.

Representative Results

Materials

100 mm cell plates	Thermo Fisher Scientific	130182
40% Acrylamide/Bis 37.5:1	Bio-Rad	161-0148
Aminocaproic acid	Sigma	A2504
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Bis-tris	Sigma	B7535
Bradford protein assay kit	BioRad	5000006
Cell scrapers	Fisher	11597692
Coomassie blue G250 (Serva Blue G)	Serva	35050
Digitonin	Sigma	D141
DMEM	Lonza	12-614F/12
EDTA	Life Technologies	15575-038
FBS	Life Technologies	10270106
Fetal bovine serum	Life Technologies	10270106
Glycerol	Sigma	G5516
Gradient maker	Bio-Rad	1654120
Lauryl maltoside (n-Dodecyl β-D-maltoside)	Sigma	D4641
L-glutamine	Life Technologies	25030024
L-glutamine	Gibco	25030
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T9281
PBS	Life Technologies	BE17-516F
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140
Power supply	GE Healthcare	EPS 301
Protease inhibitors	Thermo Scientific	10137963
Trans-blot turbo mini PVDF	BioRad	1704156
Tricine	Sigma	T9784
Trypsin-EDTA	Gibco	15400054
Vertical electrophoresis apparatus	BioRad	1658004