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Abstract

Quelle: Rotoli, S. M. et al., Kombination von nicht-reduzierender SDS-PAGE-Analyse und chemischer Vernetzung zum Nachweis multimerer Komplexe, die durch Disulfid-Bindungen in Säugetierzellen in Kultur stabilisiert wurden. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video beschreibt die Technik der Trennung der Proteinproben durch nicht-reduzierende SDS-PAGE zur Analyse der multimeren Proteinkomplexe. Bei dieser Technik bleiben die Multimer-Untereinheiten eines Proteins erhalten, die von den Disulfidbindungen gehalten werden, die später durch Western Blot analysiert werden können.

Protocol

<p class="jove_title">1. Blockieren von freien Cysteinresten mit Jodacetamid

1. Züchten Sie U-2-OS-Zellen in einer 6 cm² großen Schale auf 50 % bis 60 % Konfluenz in einem Minimum an essentiellem Medium mit hohem Glukosegehalt, der 10 % fötales Rinderserum und 1 % Natriumpyruvat bei 37 °C in 5 % CO₂ enthält.
2. Stellen Sie kurz vor der Verwendung einen frischen Vorrat von 10 mM Iodacetamid her und entsorgen Sie dann alle nicht verwendeten Reagenzien.
3. Geben Sie 0,1 mM Endkonzentration Iodacetamid direkt in das Zellkulturmedium. Das Gericht bei Raumtemperatur 2 Min. leicht wiegen.

<p class="jove_title">2. Ernte der Zellen

1. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen.
2. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 5 ml kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung und fügen Sie dann 1 ml kaltes PBS hinzu.
3. Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellschaber vom Boden der Schale ab. Ziehen Sie mit einer 1-ml-Pipette das PBS und die Zellsuspension auf und geben Sie die gesamte Flüssigkeit in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ab.
4. Schleudern Sie die Zellen bei 7.500 x g für drei Minuten bei 4 °C. Aspirieren Sie das PBS und lassen Sie das Zellpellet zurück. Das Zellpellet kann bis zur Verarbeitung bei -80 °C gelagert werden

3. Extraktion von Protein

1. Bereiten Sie 100 μl eines 1x Lysepuffers vor, verdünnt in ddH₂O (siehe Materialtabelle). Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) unmittelbar vor Gebrauch bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugeben.
2. 50 μL des 1x Lysepuffers direkt in das Zellpellet geben und suspendieren. Inkubieren Sie dies 5 Minuten lang auf Eis.
3. Beschallung für 8 s mit dem konstanten Impulsmodus bei 40 % (siehe Materialtabelle für Ultraschallgerät; je nach Bedarf für verschiedene Ultraschallgeräte anpassen), wobei der Extrakt auf Eis gehalten wird.
4. Schleudern Sie den Extrakt bei 4 °C für 5 min bei 16.000 x g. Der Überstand ist die lösliche Proteinfraktion. Auf Wunsch kann eine Bradford-Analyse durchgeführt werden, um die Proteinkonzentration zu bestimmen.

4. Probenvorbereitung

1. Nehmen Sie 10 μL des löslichen Proteinextrakts und fügen Sie 10 μL eines 1x Laemmli SDS-Probenpuffers (4% SDS, 20% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau und 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) hinzu. Fügen Sie keine Reduktionsreagenzien hinzu.
2. Bewahren Sie die Proben auf Eis auf, wenn an diesem Tag eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt wird; für die Langzeitlagerung ist eine Temperatur von -20 °C geeignet. Erhitzen Sie die Probe unmittelbar vor dem Ausführen des Gels 5 Minuten lang auf 85 °C.

<p class="jove_title">5. In vivo Formaldehyd-Vernetzung von endogenen Proteinen in U-2 OS-Zellen

1. Züchten Sie U-2 OS-Zellen in einem 175 cm² Kolben mit einer Konfluenz von 70 % bis 80 %.
2. Führen Sie die Formaldehyd-Vernetzungsreaktion durch
   1. Aliquotieren Sie in einem Abzug eine 37%ige Formaldehydlösung, die aus kommerziellen Quellen bezogen wurde. Das Formaldehyd-Fixiermittel bis zu einer Endkonzentration von 1 % direkt in das Medium geben und 15 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubieren.
   2. Um die Reaktion zu stillen, werden 1,25 M Glycin bis zu einer Endkonzentration von 0,125 M zugegeben und bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren auf einer Wippe 5 Minuten lang inkubiert.
3. Waschen Sie die Zellen dreimal mit 5 ml kaltem PBS. Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung und fügen Sie 10 ml PBS hinzu. Die Zellen werden mit einem Zellschaber vom Boden des Kolbens abgekratzt.
4. Ziehen Sie mit einer 10-ml-Pipette das PBS und die Zellsuspension auf und geben Sie die gesamte Flüssigkeit in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen ab. Die Zellen bei 500 x g für 2 min bei 4 °C drehen. Das PBS aspirieren, dabei das Zellpellet zurücklassen.

<p class="jove_title">6. Fraktionierung von Kernen

1. Bereiten Sie 10 ml Homogenisierungspuffer vor: 0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES und 0,5 % BSA bei pH 7,4. Unmittelbar vor Gebrauch PMSF bis zu einer Endkonzentration von 1 mM und 3 ml Kernsuspensionspuffer (0,1 % Triton X-100 in PBS) hinzufügen.
2. Geben Sie 5 mL Homogenisierungspuffer direkt zum Zellpellet und suspendieren Sie es vollständig. Die Suspension wird bei 500 x g 2 min bei 4 °C zentrifugiert, dann wird der Überstand verworfen.
3. Das Pellet wird in 5 ml Homogenisierungspuffer suspendiert. Verwenden Sie einen eng anliegenden Glas-Teflon-Homogenisator, homogenisieren Sie die Zellen bei 10 Hüben/500 U/min.
4. Die Suspension wird bei 1.500 x g 10 min bei 4 ΰC zentrifugiert, dann wird der Überstand verworfen.
   HINWEIS: Verwenden Sie den Überstand zur Isolierung von Mitochondrien, indem Sie 10 Minuten lang bei 10.000 x g zentrifugieren.
5. Suspendieren Sie das Pellet in 1 mL Kernsuspensionspuffer und inkubieren Sie es 10 Minuten lang auf Eis.
6. Bei 600 x g 10 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
7. Das Pellet in 1 mL Kernsuspensionspuffer suspendieren und erneut zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand. Das endgültige Pellet besteht aus isolierten Kernen.

<p class="jove_title">7. Extraktion von Protein

1. Wiederholen Sie Abschnitt 4, mit der Ausnahme, dass Sie 25 μl des 1x-Lysepuffers direkt zum Zellpellet hinzufügen und dann suspendieren.

<p class="jove_title">8. Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie zwei Proben für SDS-PAGE vor, indem Sie jeweils 10 μl des löslichen Proteinextrakts entnehmen und 10 μl 2x Laemmli SDS-Probenpuffer und 1 μl 2-Mercaptoethanol (BME) hinzufügen.
2. Eine Probe wird 5 min lang auf 37 °C und die zweite Probe 15 min lang auf 98 °C erhitzt, um die Formaldehyd-Vernetzung umzukehren.

9. SDS-PAGE Analyse

1. Bereiten Sie 1 l 1x Tris-Glycin-Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1 % (w/v) SDS) vor.
2. Richten Sie das SDS-PAGE-Laufgerät ein.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet eine 16% vorgefertigte TGX SDS-Seite. Zu beachten ist, dass ein beliebiger Prozentsatz an Gel verwendet werden kann.
   1. Öffnen Sie gemäß dem Herstellerprotokoll die Verpackung, in der das Gel aufbewahrt wird, und entfernen Sie die Kassette.
   2. Entferne den Kamm, der die Vertiefungen auskleidet, und das Klebeband von der Unterseite der Kassette.
   3. Geben Sie das Gel in das Laufgerät.
   4. Füllen Sie die Kammer mit dem 1x Laufpuffer, bis die Vertiefungen in Flüssigkeit eingetaucht sind. Spülen Sie die Vertiefungen mit einer Kunststoffpipette mit dem Laufpuffer aus.
3. Laden Sie die Proben zusammen mit 10 μl vorgefärbtem Standardmarker auf das Gel.
4. Lassen Sie das Gel bei 200 V laufen, bis die Farbstofffront etwa 1 cm vom Boden des Gels entfernt ist.

Materials

16% precast TGX gels  	ThermoFisher	Xp00160
Bromophenol Blue
BSA 	Cell signaling	99985
Cell lysis buffer 	Cell signaling	9803
Centrifuge	Eppendorf	5415D
DMEM 	Gibco	 11330-032
EDTA  	Sigma Aldrich	M101
Electrophoresis apparatus  	Invitrogen	A25977
Fetal bovine serum  	Gibco	1932693
Formaldehyde	ThermoFisher 	28908
Glass-teflon homogenizer
Glycerol 	Sigma Aldrich 	65516
Glycine 	RPI 	636050
Hepes 	Sigma Aldrich 	H0527
Iodoacetamide 	ThermoFisher	90034
PBS  	Sigma Aldrich	P3813
Power supply  	Biorad	200120
Prestained marker  	ThermoFisher	26619
SDS	Biorad 	161-0302
Sonicator 	Branson	450
Tris Base	RPI 	T60040
Tris Buffered Saline	Sigma Aldrich	SRE0031	with Tween 20, pH 7.5 
Tris-Glycine running buffer 	VWR	 J61006
Triton X-100 	Sigma Aldrich 	T8787
U-2 OS 	ATCC	 HTB-96