Experimentelle Strategien große Gewebelücken in das verletzte Rückenmark nach akutem zu überbrücken und chronische Lesion

Zusammenfassung

Schwere Rückenmarksverletzungen führen oft zu Gewebedefekten. Es werden zwei Möglichkeiten beschrieben, solche Lücken erfolgreich zu überbrücken, um die Gewebeanpassung, regenerative Reaktionen und funktionelle Verbesserung bei Ratten durch die Implantation eines mechanischen Mikrokonnektorsystems nach akuter Verletzung und fünf Wochen nach vollständiger Rückenmarksdurchtrennung zu fördern.

Zusammenfassung

Nach einer Verletzung des Rückenmarks (SCI) eine Narbe bildet sich in der Läsion Kern, der axonalen Regeneration behindert. Überbrückung der Stelle der Verletzung nach einer Beleidigung des Rückenmarks, Tumorresektionen oder von traumatischen Unfällen Gewebedefekte können bei der Erleichterung der allgemeinen Gewebereparatur sowie regenerative Wachstum von Nervenfasern in und über den betroffenen Bereich unterstützen. Zwei experimentelle Therapiestrategien werden vorgestellt: (1) Implantation eines neuartigen microconnector Gerät in einen akut und vollständig durchtrennt Brust-Ratte Rückenmark Rückenmarksgewebe Stümpfe trennt neu anpassen, und (2) Polyethylenglykol Füllung des SCI-Website in chronisch lädierten Ratten nach Narbe Resektion. Die chronische Rückenmark Läsion in diesem Modell ist eine komplette Rückenmark durchtrennt, die 5 Wochen vor der Behandlung zugefügt wurde. Beide Methoden haben in letzter Zeit sehr viel versprechende Ergebnisse und gefördert axonalen Nachwachsen, vorteilhaft Zellinvasion und funktionelle Verbesserungen erreichtin Nagetiermodellen von Rückenmarksverletzungen.

Die mechanische microconnector System (MMS) ist ein Mehrkanalsystem aus Polymethylmethacrylat (PMMA) besteht mit einem Auslass Schlauchsystem Unterdruck auf die mMS anzuwenden Lumen somit das Rückenmark Stümpfe in die Wabenstrukturierten Löcher ziehen. Nach der Implantation in den 1 mm Gewebespalt wird das Gewebe in die Vorrichtung gesaugt. Weiterhin sind die Innenwände der mMS zur besseren Gewebeadhäsion mikrostrukturiert.

Im Falle der chronischen Ansatz Rückenmarksverletzungen, Rückenmarksgewebe - Bereich einschließlich der Narbe gefüllte Läsion - ist auf einer Fläche von 4 mm in der Länge reseziert. Nach der mikrochirurgisches scar Resektion wird der resultierende Hohlraum mit Polyethylenglykol (PEG 600) gefüllt ist, das eine ausgezeichnete Substrat bereitzustellen , um Zellinvasion, Revaskularisation, die Regeneration von Axons und sogar kompakter Remyelinisierung in vivo gefunden wurde.

Einleitung

Eine traumatische Verletzung des Rückenmarks nicht nur führt zum Verlust von Axonen , aber es weitere Ergebnisse bei Gewebedefekten , die keine regenerative Reaktionen behindern (zur Übersicht siehe ^1,2). Rückenmarksgewebe wird häufig durch sekundäre Degeneration verloren Zystenbildung oder Löchern in und um den Schädigungsbereich führt. Die meisten experimentellen therapeutischen Interventionen konzentrieren sich auf unvollständige Rückenmarksschäden wie teilweise Durchtrennung, zerdrücken oder Prellung Verletzungen mit einer Rest Rand von gesundem Gewebe. Für eine vollständige Verletzungen wie Gesamtquerschnitten erhalten von traumatischen Unfällen oder chirurgischen Eingriffen führt, wie Tumorresektionen, nur sehr begrenzte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung stehen heute ^3,4. Nach der vollständigen Durchtrennung, so dass Mechaniker Spannung der Gewebe führt Wirbelsäulenstumpf Retraktion, einen kleinen Spalt im Rückenmark. Die meisten Strategien konzentrieren , diese Lücke mit Gewebe, Zellen oder Matrizen auf Füllung ^5,6.

Hier wird eine andere Strategieist, und zwar erneut Anpassung der getrennten Stümpfe präsentiert ⁷ ein neuartiges microconnector Gerät. Hat , um die beiden Stümpfe, mechanische Kraft auf neu anpassen als leichter Unterdruck angelegt werden , um diese (Figur 1) zu erreichen. Die mechanische microconnector System (MMS) ist ein Mehrkanalsystem aus Polymethylmethacrylat (PMMA) mit wabenförmigen Löchern (1A) und mit einem Auslass Rohrsystem vorgesehen. Es wird in den Gewebespalt von kompletten Rückenmarksdurchtrennung in der Ratte (Figur 1C) resultierenden implantiert. Ein Rohr mit einer Vakuumpumpe verbunden sein , um Unterdruck an den MMS (1D) anzuwenden. Der Druck zieht abgeklemmten Rückenmark Stümpfe in die wabenförmigen Löcher der mMS, die mikrostrukturierten Wände haben , das Gewebe in Position zu halten , wenn der Druck freigegeben wird (1B). Der Schlauch kann nach der Operation und an eine osmotische Minipumpe intakt gelassen werden, umSubstanzen in die Läsion Kern (1E-F) zu infundieren.

Neben einer akuten Durchtrennung des Rückenmarks eine andere Art von vollständigen Läsion ergibt sich aus der chirurgischen Entfernung eines Tumors oder spinal einer festen chronische Läsion Narbe zu große Gewebelücken von mehreren Millimetern führen, die nicht durch den MMS so weit überwunden werden. Die Mehrzahl der Patienten mit Rückenmarkstrauma leiden an chronischen Verletzungen. Bei diesen Patienten nimmt eine voll entwickelte Narbe der Läsion Kern. Die chirurgische Entfernung der Läsion Narbe ist ein Konzept für eine Behandlung , die gegenwärtig nach experimenteller SCI ^8,9 untersucht. Während die Resektion Verfahren selbst, ohne daß erhebliche zusätzliche Beschädigung durchgeführt werden kann, muss der sich ergebende Gewebespalt mit einer geeigneten Matrix überbrückt werden, die die Regeneration der Gewebe ermöglicht und fördert, und im speziellen Fall von Verletzungen des Rückenmarks, die Regeneration von Nervenfasern zu halten und Bewegungsfunktionen fördern. es wargefunden, daß niedermolekulares Polyethylenglykol (PEG 600) ein sehr geeignetes Material für diesen Zweck ist. Sein Mangel an Immunogenität und der sehr niedrige Viskosität ermöglicht eine reibungslose Integration in das umliegende Gewebe. Insertion des Biopolymers alleine fördert die Invasion von nützlichen Zellen, einschließlich Endothelzellen, peripherer Schwann - Zellen und Astrocyten, und - was sehr wichtig ist - die Regeneration und Dehnung von Axonen der absteigenden und Faserbahnen aufsteigend sowie deren ensheathment von kompakten Myelin ^8. Diese regenerative Antworten gefunden wurden durch langfristige Funktionsverbesserungen begleitet werden. Die Kombination der Resektion von Narbengewebe und anschließender Implantation von PEG 600 stellt eine sichere und einfache, aber sehr effizientes Mittel zur Überbrückung erhebliche Gewebedefekten Rückenmark.

Protokoll

Institutionelle Richtlinien für die Tier Sicherheit und Komfort wurden eingehalten und alle chirurgischen Eingriffe und prä- und postoperative Pflege der Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Deutschen Tierschutzgesetz (Landesamt, Umwelt- und Verbraucherschutz des Landes Nordrhein-Westfalen, LANUV NRW zur Verfügung gestellt ).

1. Vollständige Durchtrennung des thorakalen Rückenmarkes von weiblichen Wistar-Ratten (220-250 g)

1. Vorbereitung des Rückenmarks
   1. Verwenden Isofluran Inhalationsanästhesie (2 - 3% Isofluran in O ₂ / NO ₂ in einem Verhältnis von 1: 2) und Bolusinjektion von Carprofen (subkutan [sc] 5 mg / kg). Die Kombination von Carprofen und dem Opioid Buprenorphin (0,02 mg / kg sc) empfohlen. Beginnen Chirurgie wenn Augenlid Reflex auf leichte Berührung mit einem Wattestäbchen und Pfotenrückzugsreflex mit einer Pinzette zu kneifen Reiz nicht mehr beobachtet.
   2. Legen Sie das Tier auf einer Heizdecke bei 37 ° C bis Körper temperatu haltenre während der Operation und stellen Augensalbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu vermeiden.
   3. Shave dem Rücken des Tieres und bereiten die Haut mit einem Hautdesinfektionsmittel.
   4. Schneiden Sie die Haut an der Mittellinie entlang der Brustwirbel für 4 cm mit einem Skalpell und öffnen. Von diesem Schritt auf, verwenden Sie chirurgische Instrumente für alle Verfahren sterilisiert (autoklaviert oder Tauchsterilisiert).
   5. Fahren Sie die Muskeln über der Brustwirbel mit einem kleinen Muskeln verspannen.
   6. Entfernen Sie die Dornfortsätze bei thorakalen 8 (Th8) und Th9 mit einem Knochen Rongeur durch vorsichtige kleine Stücke von Knochen Clipping bis die Wirbelknochen flach sind.
   7. Verwenden anatomischen Pinzette die Wirbelsäule bei Dornfortsatz Th7 zu heben und eine rongeur verwenden, um kleine Stücke von Wirbelknochen von kaudal rostral Clip, bis eine Laminektomie bei Th8 und Th9 durchgeführt wird. Belichten der Dura mater, ohne es zu beschädigen, indem sorgfältig zu einer Zeit nur wenige und sehr kleine Stücke von Wirbelknochen zu entfernen.
   8. Spannen Sie das Rückgrat von zwei Stabilisierungsklammern an Dornfortsätze Th7 und Th10, heben Sie das Tier zu Atembewegungen aus den Wirbeln entkoppeln.
2. Füllen Sie Spinal Cord Trennung bei thorakalen 8/9
   1. Heben Sie die Dura mater mit einer feinen Pinzette, schneiden Sie die Dura mater mit feinen Auge Schere in Querrichtung.
   2. Halten Sie die seitliche Schnittende der Dura mater mit einer feinen Pinzette und legen Sie eine Wirbelsäulenhaken in die subarachnoidic Raum zwischen Dura mater und Arachnoidea. Vermeiden Sie Beschädigungen der Meningen durch nicht Einstechen in die pia oder Dura mater entweder mit einer Pinzette oder Rückenmark Haken.
   3. Langsam drehen Sie den Haken alles entlang des Rückenmarks Gewebe zu platzieren, dabei nicht in die Dura zu stechen (pia noch intakt ist).
   4. Heben Sie das Rückenmark für etwa 1 bis 2 mm nach oben, bis eine Lücke an der Bauchseite zwischen Rückenmarksgewebe und Dura zu sehen ist.
   5. Legen Sie feine Augen Schere in den Raum between dura und pia und schneiden Sie das Rückenmark, während die Rücken Haken an Ort und Stelle bleibt.
   6. Heben Sie die beiden Stümpfe des Rückenmarks mit zwei Zangen und optisch komplett transection gewährleisten.
   7. Zur Kontrolle-lädierten Tieren und Tieren, die mit einer chronischen Verletzung, schließen Sie die Dura durch unterbrochene Nähte mit Monofilament nicht adsorbierbaren 9,0 Gewinde.
   8. Bei chronischen Läsionen folgen Teil 1.6.
3. mMS Implantierung
   1. Platzieren mMS über der Verletzungsstelle mit den beiden Rohren an jeder lateralen Seite des Wirbels liegen und in Läsion Hohlraum abzusenken.
   2. Nahtrohre an die Muskeln an der Seite des Wirbels mit nicht resorbierbaren Faden 4-0 Stabilisierung der mMS sicherzustellen. Achten Sie auf eine Fixierung der mMS mit einer Pinzette in diesem Schritt.
   3. Entfernen Sie den mMS Steckerstift, indem sie mit einem Paar von einer feinen Schere zu schneiden.
   4. Schließen Sie die Dura über den MMS- und vernähen es mit 9,0 Gewinde.
   5. Schließen Sie ein Rohr mit der Vakuumpumpe und Dichtungdie andere durch Klemmung.
   6. Sie vorsichtig auf Unterdruck auf die mMS durch eine Vakuumpumpe über das offene Rohr, das Rückenmark Stümpfe in die mMS Lumen zu saugen. Übernehmen des Unterdrucks für mehrere Minuten (bei maximal 10 min) und Überwachung von Sensoren (250-350 mbar).
   7. Schneiden Sie die Rohre nahe den MMS- und die Schläuche entfernen. Fahren Sie mit Schritt 1.6.
4. Die Resektion von Rückenmarksgewebe einschließlich der chronischen Lesion Scar in Woche 5 nach Erstverletzung
   1. Führen Sie die Schritte 1.1.1 - 1.1.5.
   2. Identifizieren von Narbengewebe durch braungelbes Aussehen und steife Gewebe auf der Oberseite des Rückenmarks. Entfernen Sie vorsichtig oberflächlichen Schichten von Narbengewebe, indem sie mit einer feinen Pinzette halten und Schneiden mit einer feinen Schere. Mit dieser Methode wieder zu öffnen, die Seite von Laminektomie um das Gewebe zu entlarven die Verletzung des Rückenmarks Bereich enthält. Stoppen Vorbereitung, wenn die Dura Naht visuell identifiziert wird.
   3. Spannen Sie das Rückgrat von 2 Stabilisierung klemmt bei Spinous Prozesse Th7 und Th10, und dann das Tier erheben zu Atembewegungen aus den Wirbeln entkoppeln.
   4. Mit einem kleinen Pappe Lineal messen den Bereich des Rückenmarks, die reseziert werden soll (Länge: 4 mm), und die Ränder dieser jeweiligen Gewebebereich markieren mit Quereinschnitte die anschließende Entfernung des Gewebes zu ermöglichen.
   5. Entfernen von Narbengewebe durch eine Kombination von Schneiden und Aspiration. Nehmen Sie das Gewebe aus, die aus dem Rückenmark mit den Quer Einschnitte getrennt wurde. Schon Aspiration, wenn es ausreichend ist, um die Entfernung des Gewebes zu ermöglichen. Darüber hinaus macht, wenn die steife Textur des Narbengewebes Gewebe Aspiration zu schwierig, verwenden feinen Schere dieses Gewebe zu schneiden und zu entfernen.
   6. Legen Sie ein Stück (ca. 5 mm x 5 mm x 5 mm Würfel) hämostatischer Gelatine Schwamm in den Gewebespalt bis die Blutung nachlässt. Die Gelatineschwamm wird in der Größe schrumpfen, sobald er mit Flüssigkeit getränkt ist.
5. Implantation von PEG 600
   1. Vorbereitung 1 ml reinem unverdünntem PEG 600 zur Injektion durch Erhitzen auf 37 ° C.
   2. Entfernen Gelatineschwamm.
   3. Legen Sie eine ausreichende Menge (ca. 5 bis 7 & mgr; l) von PEG in den Spalt eine 10 & mgr; l-Spritze oder eine 10 ul-Pipette.
   4. Sorgfältig decken den Bereich mit einem Stück (ca. 5 mm x 4 mm) von Dicht- / Dura-Ersatz.
   5. Befestigen Sie das Dichtungsmittel Muskelgewebe mit einigen Tropfen Gewebekleber auf die Umgebung. Legen Sie das Dichtmittel auf der Oberseite des PEG-gefüllten Resektion Lücke. Um zu verhindern ein Verrutschen des Dichtmittels, verwenden kleine Tropfen Gewebekleber auf die Ecken des Dichtungsmittels auf das umgebende Muskelgewebe fixieren. Hinweis: Vermeiden Sie ein Auslaufen des Gewebekleber auf die Rückenmarksgewebe!
6. Abschluss des Tissue und Nachsorge
   1. Suture Muskeln und Hautschicht für Schicht mit unterbrochenen Nähten mit geflochtenen adsorbierbare 4-0 Fäden
   2. Injizieren 2 × 2,5 ml Natriumchlorid (NaCl[0,9%]) bei 36 ° C für sc Rehydratation nach der Operation. Eine einzige Injektion von 5 ml NaCl würde die Haut des Tieres dehnen und unnötigen Schaden für das Tier verursachen könnten. Lassen Sie keine Tier unbeaufsichtigt bis zur vollständigen Bewusstsein wiedererlangt wird.
   3. Injizieren täglich Carprofen (sc 5 mg / kg) für mindestens 2 Tage nach der Operation. Haustier in einzelnen Käfig während der ersten 2 Tage, danach in Gruppen von 2 - 3.
   4. Bewerben Antibiotika-Behandlung (tägliche orale Verabreichung von Enrofloxacin) für den ersten postoperativen Woche.
   5. Haben manuelle Blase bei zwei bis drei Mal pro Tag für ungültig erklären, indem Sie vorsichtig den Bauch des Tieres, von rostral streicht über nach kaudal. Achten Sie darauf, nicht die Wirbelsäule des Tieres zu bewegen und nicht heben das Tier am Schwanz. Manuelles Erlöschen der vollständig täglich während der gesamten Lebenszeit Blase Tieres spinalisierten. Es muss Futterpellets und Wasserflaschen in einer Höhe zu platzieren getroffen werden, die von den Tieren erreicht werden kann, ohnestehend auf ihren Hinterpfoten. Obwohl in Hinterviertel Funktion beeinträchtigt wird, die Tiere die Käfige aktiv unmittelbar nach der Operation zu bewegen und zu erkunden. Es wird empfohlen, die Ratten in geselligen Gruppen zu halten.
   6. Bei chronischen Läsionen lassen eine Überlebenszeit der Tiere von fünf Wochen vor Narbe Resektion. Führen Sie die Schritte 1.4.

Ergebnisse

Gewebekonservierung, Axonal Nachwachsen und funktionellen Zugewinn von mMS Einpflanzung nach akutem vollständiger Durchtrennung des Rückenmarks
Es wird gezeigt , dass die akute Implantation der mMS die vollständig durchtrennt Rückenmark Stümpfe stabilisiert und verringerte Schrumpfung des Gewebes (2A im Vergleich zu B). Wie in Sagittalschnitten durch Trichrom - Färbung sichtbar gemacht , ist die grüne Bin...

Diskussion

Hier werden zwei verschiedene chirurgische Ansätze werden vorgestellt, um Gewebe Lücken im Rückenmark nach (1) akute vollständige Durchtrennung und mMS Implantation und (2) chronischen Rückenmark Läsion und faserige Entfernung von Narben und PEG-Matrix Implantation überbrücken. Beide Strategien führen zu Gewebeerhaltung und axonalen Regeneration sowie zu erheblichen Bewegungs funktionelle Verbesserung der behandelten Tiere. Für mMS von der Firma dura Naht nach der Operation eine ausreichende Fixierung der mMS innerhalb ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
PEG 600 Ph Eur	Merck/VWR	8.170.041.000
Gelastypt Gelatine-Biskuit	sanofi Aventis	PZN-8789582
Nescofilm Dichtmittel	Roth	2569.1
Baytril	Bayer
Rimadyl (Carpofen)	Pfizer
Forene (Isofluran)	Abbvie
Kodan (Hautdesinfektionsmittel)
Histoacryl (Gewebekleber)
Friedman-Pearson Rongeur, 1 mm Becher, gerade	Fine Science Tools	16020-14
Zwei-in-Eins-Mikrospatel - 12 cm	Fine Science Tools	10091-12
Dumont #7 Pinzette - Inox Medical	Fine Science Tools	11273-20
Dumont #5/45 Pinzette - Inox Medical	Fine Science Tools	11253-25
Haken für das Rückenmark	Fine Science Tools	10162-12
Schere	Fine Science Tools	14078-10
Klemme	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer
Anatomische Pinzette	Fine Science Tools	11000-13
Selbsthaltender Retraktor	Fine Science Tools	17008-07
Hautklammer	Fine Science Tools	13008-12
Aluspray	Selectavet