Een snelle en doeltreffende methode om te ontleden pop vleugels van Drosophila geschikt voor Immunodetections of PCR-testen
Summary
De mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in Drosophila weefsels is essentieel voor de studie van hun overvloed en localisatie gerelateerde aan het ontwikkelingsproces. Hier is de beschrijving van een eenvoudige procedure om te ontleden pop vleugels. Deze vleugels kunnen worden gebruikt als de monsters in verschillende technieken (PCR assay, immunohistochemistry, enz.).
Abstract
Vleugel ontwikkeling bij Drosophila melanogaster is een ideaal model voor het bestuderen van de morfogenese weefsel niveau. Deze aanhangsels ontwikkelen uit een groep van cellen met de naam imaginaire schijven vleugel gevormd tijdens de embryonale ontwikkeling. In de larvale stadia groeien de imaginaire schijven, verhoging van het aantal cellen en de vorming van monolayered epitheliale structuren. In de pop behuizing, de imaginaire schijven bud uit en vouw in bilayers langs een lijn die de toekomstige marge van de vleugel wordt. Tijdens dit proces zijn de longitudinale primodia aderen afkomstig ader cellen op de potentiële dorsale en ventrale oppervlak van de vleugel. Tijdens het popstadium communiceren de strepen van ader cellen van elk oppervlak om het genereren van strakke buizen; op hetzelfde moment beginnen de Kruis-aders hun vorming.
Met behulp van passende moleculaire merkers is het mogelijk om de belangrijke elementen samenstellen van de vleugel tijdens zijn ontwikkeling te identificeren. Om deze reden is de mogelijkheid om nauwkeurig detecteren afschriften of eiwitten in deze structuur cruciaal voor het bestuderen van hun overvloed en localisatie verbonden met het ontwikkelingsproces van de vleugel.
De procedure beschreven hier richt zich op het manipuleren van pop vleugels, het verstrekken van gedetailleerde instructies over hoe om te ontleden de vleugel tijdens het popstadium. De dissectie van pop weefsel is moeilijker uit te voeren dan hun tegenhangers in derde instar-larven. Dit is de reden waarom deze aanpak werd ontwikkeld, om snelle en efficiënte hoge kwaliteit monsters krijgen. Details over het immunokleuring en mount deze vleugel monsters, dat de visualisatie van proteïnen of celbestanddelen, vindt u in het protocol. Met weinig deskundigheid is het mogelijk om te verzamelen van 8-10 hoge kwaliteit pop vleugels in een korte hoeveelheid tijd.
Introduction
Drosophila vleugels zijn ontwikkeld op basis van de vleugel imaginaire schijven. De primordiale van deze vleugel schijven zijn opzij zetten tijdens de embryonale ontwikkeling als kleine groepen van 20-30 imaginaire cellen die van de embryonale epitheel invaginate. Terwijl de larve naar de derde fase van de instar groeit, optreden mitose in de imaginaire cellen op specifieke karakteristiek tijden het verhogen van de nummers (ongeveer 50000 cellen) en de vorming van de vleugel disc1,2,3, 4. Als de cellen verspreiden, mode ze een tubulaire epitheel, resulterend in een zelf vouwen compacte spiraal. Tijdens verpopt, de schijf epitheel telescopen uit aan de twee-gelaagde vorm wing en de longitudinale aders beginnen als lacunes tussen hen, die tweemaal tijdens vleugel developmental5,6optreedt.
De rangschikking van de aderen altijd heeft een identieke patroon; de mogelijkheid om gemakkelijk identificeren dat bij iedere wijziging in de aderen vorming maakt mutaties uiterst zichtbaar (bijvoorbeeld ontbrekende of extra aderen, veranderingen in de ader posities, enz.). Interessant is dat zijn het fenotype variaties meestal het bewijs van mutaties in bekende of nieuwe onderdelen van signalering van trajecten die relevant voor de ontwikkeling van de vleugel zijn. Een van de trajecten die speelt een rol bij het bepalen van de positie en onderhouden ader en intervein gebieden is de egel (Hh) traject6,7,8.
Gezien het belang van de pop vleugel als een modelsysteem, is het belangrijk om goede kwaliteit te werken met monsters. In het verleden, hebben de wetenschappers die protocollen voor het ontleden van Drosophila vleugels hebben gepubliceerd een passende gids voor het bereiken van werkbare monsters niet gegeven. Zonder begeleiding van een onderzoeker kan niet een duidelijk visualiseren van het proces. In deze alternatieve ontleden benaderingen is de verpopping gesplitst in twee, het scheiden van de vleugel van het omliggende weefsel en herhaaldelijk gewassen om te verwijderen van het puin. Dit soort benadering vorderingen te verlaten de vleugel gratis verontreinigt maar als gevolg van eerdere ervaring het proces is langzamer en is er een hogere kans van de structuur van de breekbare vleugels9in gevaar te brengen.
De hier beschreven procedure werd ontwikkeld door de vraag te vinden van een snelle en efficiënte werkwijze te halen pop vleugel monsters geschikt specifieke proteïnen of afschriften met behulp van immunodetection protocollen of polymerase kettingreactie (PCR) tests op te sporen. Om te illustreren de expressie en de lokalisatie van Patched (Ptc of de canonieke receptor van het leertraject Hh) wordt aangetroffen in pop vleugel monsters, bieden een protocol waarin de relevante details met succes uit te voeren voor de volledige procedure.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode van dissectie beschreven in deze video kan worden gebruikt om hoge kwaliteit monsters van Drosophila pop vleugels uit verschillende ontwikkelingsstadia voor vele soorten technieken (bijvoorbeeld, immunofluorescentie, cDNA synthese voor PCR bepalingen, in vitro vleugel ontwikkeling). In termen van deze methode hebben de betrokken wetenschapper 24-30 h APF gebruikt. Echter er moet niet worden gehinderd in de essentiële stappen in dissectie van jonger of ouder Verpopping. Veranderinge…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken CSIC voor de financiële steun aan dit project, Mariana Di Doménico voor haar technische bijstand met confocale microscopie; naar José Leonardo Báez voor zijn manuscript correcties; naar Luciano Correa voor zijn toewijding aan de oprichting van de video; voor Natalia Rosano voor leningen van haar stem voor de video en de Bloomington Drosophila voorraad Center voor het verstrekken van de voorraden in deze studie gebruikt. De Apa1 monoklonaal anti-Ptc ontwikkeld door Isabel Guerrero was verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa, afdeling biologische wetenschappen, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
Referenzen
- Serrano, N., O’Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
