一种快速高效解剖蛹期翅的方法 果蝇 适用于免疫检测或PCR实验

摘要

准确检测转录本或蛋白质的能力 果蝇 组织对于研究其在发育过程中丰度和定位至关重要。以下是解剖蛹翅的简易操作步骤描述。这些翅组织可作为多种技术的样本使用（免疫组织化学、PCR检测， 等等。).

摘要

Drosophila melanogaster 的翅发育是研究组织水平形态发生的理想模型。这些附肢起源于胚胎发育期间形成的、被称为翅成虫盘的一群细胞。在幼虫阶段，成虫盘不断生长，细胞数量增加，形成单层上皮 结构。在蛹期内，成虫盘向外突出并沿一条线折叠成双层，该线将发育为翅的边缘。在此过程中，纵向的脉原基在翅的背侧和腹侧预定区域诱导形成脉细胞。在蛹发育阶段，每侧表面的脉细胞条带相互连接，形成致密的管状结构；与此同时，横脉开始形成。

借助适当的分子标记物，可以鉴定翅膀发育过程中组成翅膀的主要结构。因此，准确检测该结构中转录本或蛋白质的表达水平和定位情况，对于研究其在翅膀发育过程中的丰度和分布至关重要。

本文所述方法主要针对蛹期翅膀的操作，详细介绍了在蛹期解剖翅膀的具体步骤。蛹期组织的解剖难度高于三龄幼虫的相应组织，因此开发了本方法以快速、高效地获得高质量样品。本实验方案还提供了对这些翅膀样品进行免疫染色和封片的具体操作细节，以便观察蛋白质或细胞组分。只需少量经验，即可在短时间内收集到8至10个高质量的蛹期翅膀样本。

引言

Drosophila 的翅膀由翅成虫盘发育而来。这些翅成虫盘的原基在胚胎发育期间即已形成，作为来自胚胎上皮内陷的20-30个成虫细胞的小细胞群被保留下来。随着幼虫生长至三龄阶段，成虫细胞在特定的特征性时间点发生有丝分裂，细胞数量逐渐增加（约达50000个），最终形成翅成虫盘^1,2,3,4。在细胞增殖过程中，它们形成管状上皮结构，进而自我折叠成紧密的螺旋状。在化蛹期间，成虫盘上皮向外伸展，形成双层的翅结构，而纵脉则起源于两层之间的空隙，这一过程在翅的发育过程中发生两次^5,6。

静脉的排列始终具有一种相同的模式； 能够轻松识别静脉形成过程中的每一种改变，使得突变表现得极为明显（例如 缺失或额外的静脉，静脉位置的改变， 等等值得注意的是，表型变异通常是已知或新发现的与翅发育相关的信号通路组分发生突变的证据。其中，决定翅脉与翅间区域位置并维持其分区的一个重要信号通路是Hedgehog（Hh）通路。^6,7,8.

鉴于蛹期翅膀作为模式系统的重要性，获得高质量的样品至关重要。过去，已发表解剖方案的科学家们 果蝇 翅膀尚未提供获取可用样本的适当指导。若无研究人员的指导，人们难以清晰地理解该操作过程。在这些替代的解剖方法中，需将蛹体一分为二，分离翅膀及其周围组织，并反复清洗以去除碎片。此类方法声称可使翅膀免受污染，但根据以往经验，该过程更为耗时，且更易破坏脆弱翅膀的结构完整性⁹.

此处所述方法的开发源于对一种快速高效获取蛹期翅样本技术的需求，该样本需适用于通过免疫检测技术或聚合酶链式反应（PCR）检测特定蛋白质或转录本。为说明这一点，本文展示了Patched（Ptc，即Hh信号通路的经典受体）的表达与定位情况。 在蛹翅样本中检测到，提供了一个包含相关细节的方案，以成功完成整个实验流程。

方案

第1天

1. 蛹的采集与培养。

1. 使用湿润的毛笔从培养瓶中移除0小时蛹壳形成（APF）或未成熟蛹，并将其转移至新培养瓶中，以完成几乎整个发育期（见2.1和2.2）。
   注意： 应采用标准培养方案维持果蝇的健康种群。在成虫产卵三至四天后，可将其从试管中移除，以促进后代个体的正常发育。果蝇需在恒定温度下培养，直至三龄幼虫开始化蛹。幼虫与蛹的转变阶段以预蛹的形成为标志。 将此视为0小时APF。预蛹是静止不动的白色幼虫，呈长圆形，具有突出的前气门。

第2天

2. 转移、解剖与固定。

1. 用毛笔将蛹（在发育时间完成前2小时）转移到已粘贴双面胶的载玻片上。将蛹排列成一行，背面向上，头部朝向同一方向。
2. 将载玻片放回恒温环境中，使蛹完成相应的发育时间（即 24–30 h APF）。
   注意： 带有双面胶的载玻片将作为临时解剖平台，用于去除蛹壳（见下文）。将载玻片置于外界环境（脱离培养瓶）的时间有助于干燥蛹壳，使其更易用镊子破碎。
3. 使用镊子移除蛹壳上的气门盖（operculum）。
4. 用镊子沿蛹体侧面至尾端方向划开蛹壳（如视频所示），形成一条裂口。在适当照明条件下，可观察到蛹体内轮廓，清晰可见翅铰合处上方存在一空隙。该空隙可作为解剖开口的参考标志，避免损伤蛹体。
5. 从切口边缘夹起蛹壳碎片，并将其翻折至对侧，由双面胶固定。解剖结束后，蛹体几乎呈"裸露"状态，仅尾端末端残留少量蛹壳覆盖。
   注意：保留尾端上方少量蛹壳的目的是确保蛹体能平稳地从壳中释放并粘附于双面胶载玻片上。若去除过多蛹壳，极易损伤蛹体；反之，若去除过少，则蛹体难以顺利脱离蛹壳。
6. 用镊子向下按压残留的蛹壳部分，此动作可抬高蛹体前端，使头部和胸部保持理想位置，便于后续粘附和转移。
7. 取一张新的带有双面胶的载玻片，将其倒置覆盖在蛹或成行的蛹列上。建议在体视显微镜下操作，以观察移动过程，防止蛹体破损。
8. 轻轻按压，使蛹体粘附于胶带上，然后缓慢滑动载玻片，将蛹体从剩余蛹壳中分离。翻转载玻片后，蛹体将以背侧朝上、头部/胸部区域粘附于胶带上的状态固定。
9. 用4%多聚甲醛覆盖所有裸露的蛹体，静置10分钟。根据我们的经验，此固定时间有助于改变表皮的物理性质，使其变硬、减少黏性，更易于操作。
   注意： 若需进行核糖核酸（RNA）提取，应以无RNase水配制的磷酸盐缓冲液（PBS）替代多聚甲醛，并在各附肢铰合点附近剪开，去除蛹翅。使用镊子将蛹翅转移至含1 mL异硫氰酸胍-苯酚试剂的微量离心管中。收集50–80个蛹翅后，将离心管储存于-80 °C，直至进行RNA提取^10,11。
10. 在翅铰合区或其附近做一小切口，使固定液能够渗入翅上皮组织。使用移液器（p200）反复冲洗翅表面，每次冲洗后更换被污染的固定液。冲洗完成后，将翅继续置于固定液中5分钟。
    注意： 尽管该操作有助于清除大部分污染组织，但仍可能有部分血细胞和脂肪滴残留在翅背侧与腹侧上皮层之间（见图1A）。
11. 用镊子从表皮边缘撕开（如视频所示），扩大切口，使翅上皮组织从表皮囊中释放出来。一旦翅组织完全释放，将其保留在多聚甲醛溶液中，继续固定至总时长30分钟。
12. 将固定后的翅转移至一个四孔塑料培养皿中，皿内盛有PBST（含0.05% Triton X-100）。于4 °C过夜保存。

第3天

3. 一抗孵育。

1. 将蛹翅组织置于含0.2% Triton X-100的PBST中，于摇床上孵育15分钟，以实现组织通透，同时促进液体介质轻柔流动。
   注意：在完成样本封片 之前，所有步骤均应于摇床上进行。
2. 使用PBSTA缓冲液（含3% BSA和0.1% Triton X-100）封闭样本，孵育1小时。
3. 用相同缓冲液稀释一抗（小鼠抗Ptc抗体，1:100），于4 °C条件下孵育蛹翅过夜。

第4天

4. 二抗孵育。

1. 用 PBST（含 0.05% Triton X-100）洗涤样品，每次 10 分钟，共洗 4 次
2. 在避光条件下，于室温下用适当浓度的二抗（e.g.，荧光染料标记的抗小鼠抗体）在 PBSTA（含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100）中孵育样品，孵育 2 小时。
   注意：如适用，可使用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和/或鬼笔环肽对组织进行复染。请结合二抗所用荧光染料的发射波长，将这些探针与二抗同时加入，以避免信号重叠。
3. 用 PBST（含 0.05% Triton X-100）洗涤样品，每次 10 分钟，共洗 4 次

5. 封片

1. 通过在载玻片上放置4滴透明指甲油来制备样品载片，使指甲油滴呈正方形的四个顶点状分布。这些指甲油滴将作为盖玻片的支撑点，有助于避免压碎组织。
2. 在指甲油滴形成的正方形中央加入30 µL封片介质（80%甘油/Tris-HCl），注意不要接触到任一角上的指甲油滴。取一支带有黄色截短吸头的移液器，吸取少量封片介质，然后吸入数个蛹期翅组织。
3. 将蛹期翅转移至载玻片中央的封片介质液滴中。借助吸头轻轻铺展封片介质，并使蛹期翅沉入其中，以防止其漂浮。若在加盖盖玻片时翅组织保持平整，则其形态结构将得以维持。在加盖盖玻片前，需去除气泡。
4. 将盖玻片缓缓盖下，覆盖样品，尽量避免产生气泡。此操作可借助镊子完成。

结果

本方案提供了一种简便的方法，用于获取保持翅膀典型形态的蛹期翅膀样本。利用这些样本可获得图像序列，进而投影为二维或三维图像，以研究蛋白质在翅膀分化过程中的分布和/或富集情况。采用类似方案（见步骤2.9中的说明）可收集大量蛹期翅膀样本（包含50–80个蛹期翅膀），用于合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），后者是PCR反应中所用的模板。

图1...

讨论

本视频中描述的解剖方法可用于制备高质量的样本 果蝇 不同发育阶段的蛹翅，适用于多种技术例如， 免疫荧光，cDNA 合成至 PCR 检测 体外 翅发育）。采用该方法的研究人员使用了24-30小时的蛹期（APF）。然而，对更年轻或更年老的蛹进行解剖时，其基本操作步骤应无困难。但对于发育阶段较小的蛹，可能需要进行适当调整以适应其尺寸。

该方案可用于同时解剖一只或数只蛹，有助于加快操作进程，从而更高效地完成大量翅膀的解剖。在此情况下，可选择同时移出4-5只蛹组成的一列。可将这些蛹一同移出，若无法实现，则可逐一移出至同一载玻片上（参见视频第III部分：“"Multiple pupae dissection"”）。从打开的蛹壳中取出裸蛹时，需确保其后端末端足够小。虽然可以将整个蛹壳完全去除，这会使转移过程更快，但完全去除蛹壳操作难度较大，且更容易损伤蛹体。

经验表明，一个重要的操作步骤是将蛹保留在载玻片上，并置于培养箱内但远离小瓶的地方，留出最后2小时以完成规定的发育时...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
配备冷光源照明的体视显微镜	Nikon	SMZ1000
摇床平台	Biometra (WT 16)	042-500
显微镜载玻片	StarFrost	8037/1
盖玻片（24 × 32 mm）	Deltalab	D102432
镊子	F.S.T	11252-00
剪刀	Lawton	63-1400
多孔塑料培养皿	Thermo Scientific	144444
p100 或 p200 移液器	Finnpipette (Labsystems)	9400130
1× PBS（Dulbecco 配方）	Gibco	21600-010
4% 多聚甲醛	Sigma	158127
Triton X-100	Sigma	T8787
BSA	Bio Basic INC.	9048-46-8
甘油	Mallinckrodt	5092
Tris	Amresco	497
TRIzol 试剂	Ambion	15596026
DEPC 处理水	MO.BIO	17011-200
Alexa Fluor 546 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L），2 mg/mL （工作稀释比例 1/800）	Invitrogen	A11030
单克隆抗 Ptc 抗体（Apa-1），54 μg/mL （工作稀释比例 1/100）	发育研究杂交瘤库（DSHB）		由 Isabel Gerrero 提供，隶属于 NICHD 支持下的发育研究杂交瘤库（DSHB），由爱荷华大学生物科学系（爱荷华市，IA 52242，美国）维护。
DAPI，1 mg/mL （工作稀释比例 1/5000）	Invitrogen	62248
Alexa 488 标记的鬼笔环肽，300 U/1.5 mL 甲醇 （工作稀释比例 1/600）	Invitrogen	A12379
Canton S（果蝇品系）	Bloomington 果蝇品系中心