准确检测转录本或蛋白质的能力 果蝇 组织对于研究其在发育过程中丰度和定位至关重要。以下是解剖蛹翅的简易操作步骤描述。这些翅组织可作为多种技术的样本使用（免疫组织化学、PCR检测， 等等。).
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本文内容
摘要
摘要
Drosophila melanogaster 的翅发育是研究组织水平形态发生的理想模型。这些附肢起源于胚胎发育期间形成的、被称为翅成虫盘的一群细胞。在幼虫阶段，成虫盘不断生长，细胞数量增加，形成单层上皮 结构。在蛹期内，成虫盘向外突出并沿一条线折叠成双层，该线将发育为翅的边缘。在此过程中，纵向的脉原基在翅的背侧和腹侧预定区域诱导形成脉细胞。在蛹发育阶段，每侧表面的脉细胞条带相互连接，形成致密的管状结构；与此同时，横脉开始形成。
借助适当的分子标记物，可以鉴定翅膀发育过程中组成翅膀的主要结构。因此，准确检测该结构中转录本或蛋白质的表达水平和定位情况，对于研究其在翅膀发育过程中的丰度和分布至关重要。
本文所述方法主要针对蛹期翅膀的操作，详细介绍了在蛹期解剖翅膀的具体步骤。蛹期组织的解剖难度高于三龄幼虫的相应组织，因此开发了本方法以快速、高效地获得高质量样品。本实验方案还提供了对这些翅膀样品进行免疫染色和封片的具体操作细节，以便观察蛋白质或细胞组分。只需少量经验，即可在短时间内收集到8至10个高质量的蛹期翅膀样本。
引言
Drosophila 的翅膀由翅成虫盘发育而来。这些翅成虫盘的原基在胚胎发育期间即已形成，作为来自胚胎上皮内陷的20-30个成虫细胞的小细胞群被保留下来。随着幼虫生长至三龄阶段，成虫细胞在特定的特征性时间点发生有丝分裂，细胞数量逐渐增加（约达50000个），最终形成翅成虫盘1,2,3,4。在细胞增殖过程中，它们形成管状上皮结构，进而自我折叠成紧密的螺旋状。在化蛹期间，成虫盘上皮向外伸展，形成双层的翅结构，而纵脉则起源于两层之间的空隙，这一过程在翅的发育过程中发生两次5,6。
静脉的排列始终具有一种相同的模式； 能够轻松识别静脉形成过程中的每一种改变，使得突变表现得极为明显（例如 缺失或额外的静脉，静脉位置的改变， 等等值得注意的是，表型变异通常是已知或新发现的与翅发育相关的信号通路组分发生突变的证据。其中，决定翅脉与翅间区域位置并维持其分区的一个重要信号通路是Hedgehog（Hh）通路。6
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方案
第1天
1. 蛹的采集与培养。
- 使用湿润的毛笔从培养瓶中移除0小时蛹壳形成（APF）或未成熟蛹，并将其转移至新培养瓶中，以完成几乎整个发育期（见2.1和2.2）。
注意： 应采用标准培养方案维持果蝇的健康种群。在成虫产卵三至四天后，可将其从试管中移除，以促进后代个体的正常发育。果蝇需在恒定温度下培养，直至三龄幼虫开始化蛹。幼虫与蛹的转变阶段以预蛹的形成为标志。 将此视为0小时APF。预蛹是静止不动的白色幼虫，呈长圆形，具有突出的前气门。
第2天
2. 转移、解剖与固定。
- 用毛笔将蛹（在发育时间完成前2小时）转移到已粘贴双面胶的载玻片上。将蛹排列成一行，背面向上，头部朝向同一方向。
- 将载玻片放回恒温环境中，使蛹完成相应的发育时间（即 24–30 h APF）。
注意： 带有双面胶的载玻片将作为临时解剖平台，用于去除蛹壳（见下文）。将载玻片置于外界环境（脱离培养瓶）的时间有助于干燥蛹壳，使其更易用镊子破碎。 - 使用镊子移除蛹壳上的气门盖（operculum）。
- 用镊子沿蛹体侧面至尾端方向划开蛹壳（如视频所示），形成一条裂口。在适当照明条件....
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结果
本方案提供了一种简便的方法，用于获取保持翅膀典型形态的蛹期翅膀样本。利用这些制备样本，可以获得图像序列，可用于投影为二维或三维图像，以研究蛋白质在翅膀分化过程中的分布和/或富集情况。类似的方案（参见2.9中的说明）可用于收集大量蛹期翅膀样本（包含50–80个蛹翅），以合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），作为PCR反应中的模板。
图1：Hedgehog 信号通路基因在 果蝇 蛹翅.......
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讨论
本视频中描述的解剖方法可用于制备高质量的样本 果蝇 不同发育阶段的蛹翅，适用于多种技术例如， 免疫荧光，cDNA 合成至 PCR 检测 体外 翅发育）。采用该方法的研究人员使用了24-30小时的蛹期（APF）。然而，对更年轻或更年老的蛹进行解剖时，其基本操作步骤应无困难。但对于发育阶段较小的蛹，可能需要进行适当调整以适应其尺寸。
该方案可用于同时解剖一只或数只蛹，有助于加快操作进程，从而更高效地完成大量翅膀的解剖。在此情况下，可选择同时移出4-5只蛹组成的一列。可将这些蛹一同移出，若无法实现，则可逐一移出至同一载玻片上（参见视频第III部分：“"Multiple pupae dissection"”）。从打开的蛹壳中取出裸蛹时，需确保其后端末端足够小。虽然可以将整个蛹壳完全去除，这会使转移过程更快，但完全去除蛹壳操作难度较大，且更容易损伤蛹体。
经验表明，一个重要的操作步骤是将蛹保留在载玻片上，并置于培养箱内但远离小瓶的地方，留出最后2小时以完成规定的发育时.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢西班牙高等科研理事会（CSIC）为本项目提供的经费支持，感谢Mariana Di Doménico在共聚焦显微镜技术方面的协助，感谢José Leonardo Báez对稿件的修改意见，感谢Luciano Correa为视频制作所付出的努力，感谢Natalia Rosano为视频提供配音，以及感谢布卢明顿果蝇资源中心（Bloomington Drosophila Stock Center）提供本研究中使用的果蝇品系。由Isabel Guerrero研发的Apa1单克隆抗Ptc抗体来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank, DSHB），该库由美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）资助，并由爱荷华大学生物科学系（The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242）负责维护。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 配备冷光源照明的体视显微镜 | Nikon | SMZ1000 | |
| 摇床平台 | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| 显微镜载玻片 | StarFrost | 8037/1 | |
| 盖玻片（24 × 32 mm） | Deltalab | D102432 | |
| 镊子 | F.S.T | 11252-00 | |
| 剪刀 | Lawton | 63-1400 | |
| 多孔塑料培养皿 | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 或 p200 移液器 | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1× PBS（Dulbecco 配方） | Gibco | 21600-010 | |
| 4% 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| 甘油 | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol 试剂 | Ambion | 15596026 | |
| DEPC 处理水 | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L），2 mg/mL （工作稀释比例 1/800） | Invitrogen | A11030 | |
| 单克隆抗 Ptc 抗体（Apa-1），54 μg/mL （工作稀释比例 1/100） | 发育研究杂交瘤库（DSHB） | 由 Isabel Gerrero 提供，隶属于 NICHD 支持下的发育研究杂交瘤库（DSHB），由爱荷华大学生物科学系（爱荷华市，IA 52242，美国）维护。 | |
| DAPI，1 mg/mL （工作稀释比例 1/5000） | Invitrogen | 62248 | |
| Alexa 488 标记的鬼笔环肽，300 U/1.5 mL 甲醇 （工作稀释比例 1/600） | Invitrogen | A12379 | |
| Canton S（果蝇品系） | Bloomington 果蝇品系中心 |
参考文献
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T.
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重印与许可
