हम व्यक्तिगत खमीर कोशिकाओं के विकास के phenotypes की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं क्योंकि वे समय-व्यतीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए ठोस मीडिया पर कालोनियों में बढ़ते हैं, ये खमीर के रहने वाले कक्षों (ओडेलेय) के एक-सेल दोलिंग मूल्यांकन। कॉलोनियों में बढ़ रहे आनुवंशिक रूप से समान कोशिकाओं की जनसंख्या की विविधता को सीधे देखा जा सकता है और मात्रा निर्धारित की जा सकती है।
सूक्ष्मजीवों के विकास के phenotypes उनके अंतर्निहित आनुवंशिक फिटनेस का एक मजबूत संकेतक हैं और उन्हें 3 विकास नियमों में विभाजित किया जा सकता है: अंतराल चरण, लॉग-चरण और स्थिर चरण। प्रत्येक विकास चरण विभिन्न पर्यावरणीय और आनुवंशिक स्थितियों से संबंधित फिटनेस के विभिन्न पहलुओं को प्रकट कर सकता है। उच्च संकल्प और वृद्धि के सभी 3 चरणों के मात्रात्मक माप आम तौर पर प्राप्त करना मुश्किल है। यहां हम लिविंग एरेज़ ऑफ़ यीस्ट (ओडेलेय) के एक-सेल दोहरीकरण मूल्यांकन नामक एक परख के माध्यम से ठोस मीडिया पर सभी 3 विकास चरणों को चिह्नित करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं। ऑडेलेल टाइम-लिक्स्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए ठोस मीडिया पर कॉलोनियों में बढ़ रहे व्यक्तिगत कोशिकाओं के विकास के फेनोटॉप्स को मात्रा में बताते हैं। यह विधि जनसंख्या के समान कोशिकाओं में प्रत्येक विकास पैरामीटर के साथ जनसंख्या की विविधता का प्रत्यक्ष निरीक्षण कर सकती है, जो कि उपनिवेशों में बढ़ती हैं। जनसंख्या की विविधता आनुवंशिक और एपिगेनेटिक विनियमन को समझने के लिए एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य प्रदान करती है, और इसके जवाबआनुवांशिक और पर्यावरण संबंधी परेशानियां यद्यपि ओडेले की पद्धति को खमीर के प्रयोग से प्रदर्शित किया जाता है, तो इसका उपयोग सूक्ष्म जीवाणु बनाने वाले किसी भी कॉलोनी पर किया जा सकता है जो उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई देता है।
सूक्ष्मजीवों के विकास के फीनोटाइप्स को दी गई पर्यावरणीय स्थिति में अंतर्निहित आनुवंशिक फिटनेस का एक मजबूत संकेत है। विकास को कक्षा में अलग-अलग 3 अलग-अलग विकास व्यवस्थाओं में विभाजित किया गया है: अंतराल चरण, लॉग-चरण, और स्थिर-चरण वृद्धि 1 । प्रत्येक विकास चरण में फिटनेस के विभिन्न पहलुओं को प्रकट किया जा सकता है जो विभिन्न पर्यावरणीय और आनुवांशिक स्थितियों पर निर्भर हैं। उदाहरण के लिए, अंतराल के समय, या एक जीव कितना घातीय वृद्धि की शुरुआत से पहले अंतराल में खर्च करता है, यह एक जीव की बदलती पर्यावरणीय परिस्थितियों का जवाब देने की क्षमता का संकेत हो सकता है 2 । लॉग-चरण वृद्धि के दौरान दोहरीकरण के समय, सेलुलर फिटनेस का सबसे सामान्य मीट्रिक, प्रतिरूप के लिए पर्यावरणीय सामग्रियों का मेटाबोलाइजिंग और उपयोग द्वारा विभाजित करने के लिए जीव की क्षमता की समग्र दक्षता का पता चलता है। स्थिर चरण, जहां लॉग-चरण के बाद की वृद्धि तेजी से कम हो जाती है, वह नियमित रूप से फिटनेस का एक और संकेतक हैली स्पॉट-आधारित खमीर वृद्धि assays में विकास अंत बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया।
खमीर 3 , 4 , 5 में विकास खण्डों के मूल्यांकन के लिए कई खमीर विकास आक्षेप वर्तमान में उपलब्ध हैं और माना जाता है। इन assays प्राथमिक रूप से ठोस या तरल मीडिया पर खमीर बढ़ने के तरीकों पर आधारित हैं। ठोस मीडिया पर, कॉलोनी पिनिंग एनीसन एक छोटी सी कोशिकाओं को एक पिन के साथ ठोस एगर पर स्थानांतरित करते हैं, और खमीर कोशिकाओं को एक निर्धारित अवधि के लिए बढ़ने की अनुमति है। कालोनियों को तब इमेजेट किया जाता है और उनके आकार की तुलना टर्मिनल समापन बिंदु 6 पर की जाती है । इन कॉलोनी पिनिंग एनीसन ने जेनोम चौड़ा स्क्रीन बनाने के लिए मजबूत और स्केलेबल साबित किया है। हाल ही में, फ्लैट-बिल्लैन स्कैनर और सिंगल लेंस पलटा (सीएलआर) कैमरों का आवधिक इमेजिंग इन एशेज में समय के साथ कॉलोनी विकास रिकॉर्ड करने के लिए शामिल किया गया है। 7 , 8, 9 हालांकि, इन उपकरणों का संकल्प उन्हें एकल कोशिकाओं का पता लगाने से रोकता है और इस प्रकार, इन कॉलोनी लगाए गए एसेल्स सीधे अंतराल के समय का निरीक्षण नहीं करते हैं और अलग-अलग कोशिकाओं के बीच भिन्नता का पालन नहीं कर सकते हैं जो कॉलोनियों में बढ़ते हैं।
तरल-आधारित वृद्धि assays भी जीनोम चौड़ा स्क्रीन 3 प्रदर्शन करने के लिए नियोजित किया गया है समय-चूक माइक्रोस्कोपी के साथ एक तरल वृद्धि परख को जोड़कर आनुवंशिक रूप से समान व्यक्तिगत कोशिकाओं के दोगुनी समय में आबादी विविधता का पता चला, जो आनुवांशिक विनियमन और पर्यावरण अनुकूलन को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है। हालांकि, इस परख विकास के अन्य पहलूओं को माप नहीं करता है जैसे कि अंतराल के समय और क्षमता 10 । यहाँ हम ओडेले 11 की परिभाषा के माध्यम से ठोस मीडिया पर कॉलोनी बनाने वाले सूक्ष्मजीवों के सभी तीन विकास चरणों को चिह्नित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। ओडेले में यूटीली के होते हैंठोस माध्यमों पर कॉलोनियों में बढ़ने वाले एकल कोशिकाओं की छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए उच्च थ्रूपूट समय चूक माइक्रोस्कोपी को ज़िंग करना। कॉलोनियों में बढ़ रहे व्यक्तिगत कोशिकाओं की यह आबादी अंतर्निहित आबादी विविधता का पता चलता है, जो अन्य कम संवेदनशील मापों जैसे टर्मिनल एंडपॉइंट स्कोरिंग से नहीं पता है। हम खमीर पर विधि का प्रदर्शन करते हैं, लेकिन उदर क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में इसके विपरीत दिखने वाले किसी भी जीव के लिए ओडेलेल लागू किया जा सकता है।
ओडेलेई परख में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय फीनोटाइपिक माप सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं। पहला महत्वपूर्ण मुद्दा खमीर संस्कृतियों की लगातार तैयारी है लॉगरिदमिक वृद्धि से खमीर कोशिकाओं को फसल करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यदि संस्कृतियों ने संतृप्त किया है, तो उनकी आबादी विविधता बढ़ जाएगी जो आनुवंशिक या पर्यावरणीय ( जैसे, कार्बन स्रोत) कारकों 11 के कारण विविधता को दूर कर सकती है। दूसरा महत्वपूर्ण मुद्दा मीडिया की लगातार तैयारी है। सामान्य तौर पर, 10 एक्स स्टॉक मीडिया समाधान की एक बड़ी मात्रा उत्पन्न होनी चाहिए और इसके बाद बैच प्रभाव को कम करने के लिए समय पर उपयोग किया जाना चाहिए। जब भी संभव हो, वज़न के माध्यम से मीडिया को तैयार करता है, तो अगर की घनत्व सुनिश्चित करके मध्यम समय की संगति में सुधार और एजोज की समग्र जल सामग्री को बारीकी से निगरानी रखी जा सकती है। तीसरे महत्वपूर्ण बिंदु में मुझे agarose के किसी भी यांत्रिक विरूपण को कम करने या नष्ट करना शामिल हैव्यास। कांच की स्लाइड्स से agarose के अलग होने के दौरान मीडिया के मैकेनिकल विरूपण सबसे अधिक हो जाएगा। कई प्रयोगशाला तकनीकों के साथ, इस कदम को मास्टर करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है।
चित्रा 4 में दर्शाए गए अंतराल के समय में भिन्नता, अक्सर तीन कारकों में से एक से संबंधित होती है: agarose माध्यम के यांत्रिक विरूपण, ढाला या मोटाई में परिवर्तन, या अस्थिर प्रकाश स्रोत। यदि agarose मध्यम भिन्नता वाले सरणी में ज़ेड ऊंचाई में बदलता रहता है, तो ऊंचाई भिन्नता ऑटोफोकस रूटीन की सीमा को कम कर सकती है, जिससे प्रारंभिक छवियों को फ़ोकस से थोड़ी दूर किया जा सकता है। इस कारण से, केंद्र में और स्पॉटेड सरणी के किनारों पर फोकस की ऊंचाई को जांचें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ऑटोफोकस रूटीन में फ़ोकस लगाने के लिए पर्याप्त ज़ेड रेंज है। यदि आवश्यक हो, फोकस रेंज को बढ़ाने के लिए और फ़ोकसिंग चरणों की संख्या में वृद्धि करने के लिए ऑटोफ़ोकस पैनल का उपयोग करें।
एक तीसरा संभावित कंडिटआयन जो खराब फोकस का कारण बन सकता है एक अस्थिर या अस्थिरता प्रकाश स्रोत है, जो एक विशिष्ट Z- ऊंचाई के लिए गणना फ़ोकस स्कोर को बाधित कर सकता है। टंगस्टन हलोजन बल्ब झिलमिलाहट से पहले अच्छी तरह से बल्ब बाहर जला है। खराब फोकस का प्रभाव एक उदाहरण में मनाया जाता है जहां वृद्धि पहली और दूसरी बार अंक ( चित्रा 5 ए ) के बीच में गिरावट आती है, जबकि आसन्न जगह में एक ही डुबकी ( चित्रा 5 बी ) नहीं है। इस मामले में, टंगस्टन हलोजन प्रकाश स्रोत की जगह, खराब फोकस स्थिति को कम कर दिया गया था।
व्यवहार में, लेखकों ने पाया है कि 100W टंगस्टन हलोजन बल्ब की झिलमिलाहट को कम करने के लिए, प्रत्येक 500 घंटे या लगभग हर 2 महीने प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए जब सूक्ष्मदर्शी भारी उपयोग में हैं चंचल बल्ब से खराब फोकस वाले मुद्दों से बचने के लिए, टंगस्टन हलोजन प्रकाश स्रोत की जगह अक्सर या डायोड प्रकाश स्रोत के साथ हलोजन बल्ब की जगह। एकएक डाटासेट का उदाहरण जो दोहरीकरण के समय में कम भिन्नता दिखाता है और साथ ही अधिक वर्दी लैग का समय चित्रा 6 में दिखाया गया है। यह डेटासेट एक डायोड प्रकाशक के साथ लिया गया था जो कि ऑटोफोकस का प्रदर्शन करते समय अधिक स्थिर रोशनी प्रदान करता है।
हालांकि मीडिया तैयारी को अनुकूलित करने के लिए यहां बताए गए कई बिंदु स्पष्ट हो सकते हैं, साहित्य में, अधिकांश बड़े स्केल स्क्रीन एक दूसरे के साथ अच्छी तरह से दोहराए नहीं जाते हैं 8 , 11 इसलिए, हमने सावधानीपूर्वक संस्कृतियों और agarose मीडिया की तैयारी का वर्णन किया है ताकि अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फ़िनोटाइपिक स्क्रीन उत्पन्न हो सकें।
सिंथेटिक आनुवंशिक सरणियों या स्कैन-ओ-मेटाटिक परख जैसे पिनिंग आधारित assays की तुलना में ओडेले परख वर्तमान में थ्रूपूट में सीमित है। हालांकि इन विधियों में मापा जाने वाले उपभेदों की संख्या में वृद्धि हुई है, लेकिन उन्हें व्यक्तिगत कोशिकाओं को हल करने की क्षमता नहीं हैइस प्रकार हम आबादी विविधता को माप नहीं सकते हैं जो हम क्लोनल खमीर उपभेदों के भीतर देखते हैं। इस आबादी की विविधता की उत्पत्ति वर्तमान में समझ में नहीं आ रही है, लेकिन तकनीक और विलय की मर्जिंग जैसा कि यहां दिखाया गया है, वह अंतर्निहित सेलुलर तंत्र 12 को निष्पक्ष रूप से संबोधित करने का अवसर प्रदान करता है।
लेखकों को यह नोट करना है कि वर्तमान में केवल एक विशिष्ट माइक्रोस्कोप ब्रांड और शरीर के प्रकार के लिए अनुकूलित किया गया है। अन्य सूक्ष्मदर्शी प्रणालियों के लिए ODELAY संशोधित करना सीधे आगे है लेकिन ओपन सोर्स एपीआई 13 के ज्ञान की आवश्यकता होगी। हालांकि, एपीआई और साथ ही ओडेलेय लिपियों को आसानी से विभिन्न प्रणालियों और प्रयोगात्मक assays के लिए अनुकूलित करने के लिए लिखा जाता है।
चूंकि ओडेले मूल रूप से खमीर के लिए विकसित किया गया था, हम माइकोबैक्टीरियम स्मेग्मैटिस के विकास को ध्यान में रखते हुए इसे बिना किसी संशोधन के उपयोग में ला पाए हैं। सूक्ष्मजीव बनाने वाली अन्य कॉलोनी का निरीक्षणस्रोत कोड में परिवर्तन के साथ संभव 11 प्रदान सामान्य तौर पर, ओडेलेई विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों और आनुवांशिक उलझनों के तहत विकसित सूक्ष्मजीवों की तुलना करने के लिए एक शक्तिशाली और लचीला उपकरण है।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों ने यूरीआईआर आरआर022220 और पी 50 जीएम076547 को अमेरिका के नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ से जेडीए को अनुदान के द्वारा इस काम के लिए समर्थन स्वीकार किया है। एफडीएम कैनेडियन इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च के साथ एक पोस्टडॉक्टरल फेलो है हम समर्थन के लिए लक्समबर्ग सेंटर फॉर सिस्टम्स बायोमेडिसिन और लक्ज़मबर्ग विश्वविद्यालय का भी धन्यवाद करते हैं।
Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm |
Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
50mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
15mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
96 well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.comODELAY for Matlab scripts and software | ||
ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.comODELAY for Mechanincal Drawings | ||
ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.comODELAY for mold drawings |