Das transiente Rezeptor-Potenzial Vanilloid Typ 1 (TRPV1) in der supraspinalen Region wurde vorgeschlagen, einige Rollen in der Gehirnfunktion zu spielen. Beschrieben hier ist ein Protokoll für die intracerebroventrikuläre Injektion von Harziferatoxin zur supraspinalen TRPV1-Desensibilisierung bei Mäusen. Es werden auch Verfahren für einige Schmerztests vorgestellt.
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Methodenartikel
Intracerebroventrikuläre Behandlung mit Resiniferatoxin und Schmerztests bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das transiente Rezeptorpotential Vanilloid Typ 1 (TRPV1), ein thermosensitiver Kationenkanal, ist dafür bekannt, Schmerzen in den peripheren Nerven auszulösen. Neben seiner peripheren Funktion, seine Beteiligung an Gehirnfunktionen wurde auch vorgeschlagen. Resiniferatoxin (RTX), ein ultrapotenter TRPV1-Agonist, ist dafür bekannt, eine langfristige Desensibilisierung von TRPV1 zu induzieren, und diese Desensibilisierung war ein alternativer Ansatz zur Untersuchung der physiologischen Relevanz von TRPV1-exezierenden Zellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur intracerebroventrikulären Behandlung (i.c.v.) mit RTX bei Mäusen. Es werden Verfahren zur Prüfung der Nozieption zur peripheren TRPV1-Stimulation (RTX-Test) und zur mechanischen Stimulation (Schwanzdrucktest) beschrieben. Obwohl die nozizeptiven Reaktionen von Mäusen, denen RTX i.c.v. verabreicht worden war, mit denen der Kontrollgruppen vergleichbar waren, waren RTX-i.c.v.-verabreichte Mäuse unempfindlich gegenüber der schmerzstillenden Wirkung von Acetaminophen, was darauf hindeutet, dass die i.c.v. RTX-Behandlung eine supraspinal-selektive TRPV1-Desensibilisierung induzieren kann. Dieses Mausmodell kann als praktisches experimentelles System zur Untersuchung der Rolle von TRPV1 in der Gehirn-/Supraspinalfunktion verwendet werden. Diese Techniken können auch auf Studien über die zentralen Aktionen anderer Medikamente angewendet werden.
Einleitung
Tiere erhalten verschiedene physikalische und chemische Reize aus ihrer Umgebung durch Sensoren an den peripheren Nerven. Das transiente Rezeptorpotential Vanilloid Typ 1 (TRPV1) ist einer der thermoempfindlichen, nicht selektiven Kationenkanäle, die als Wärmesensoren1,2fungieren und die Aktivierung und/oder Modulation von TRPV1 ist bekannt als ein wichtiger Schritt für die Nozizeption sowohl in normalen als auch in entzündlichen Kontexten3. Obwohl das allgemeine Expressionsmuster umstritten ist, wurde die Expression von TRPV1 auch in supraspinalen Regionen vorgeschlagen, die an verschiedenen Gehirnaktivitäten beteiligt sind (einschließlich Nozieption4, Thermoregulation5, Angst6, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung7und Epilepsie8). Darüber hinaus wurde vor kurzem vorgeschlagen, dass Acetaminophen, ein weit verbreitetes Schmerzmittel, die Aktivierung von zentralem TRPV1 vermittelt, um seine schmerzstillende Wirkung zu entlocken9,10.
Die Verabreichung von überschüssigem TRPV1-Agonisten einschließlich Capsaicin und Harziferatoxin (RTX) an Tiere führt zum Tod von TRPV1-positiven Neuronen und einer langanhaltenden Desensibilisierung der TRPV1-Agonisten11,12. In Kombination mit der lokalen Anwendung (intrathekal13,14, intracisternal15,16,17und intraganglional18), hat dieser chemische Ablation Ansatz eine alternative Möglichkeit, die physiologischen Funktionen von TRPV1 zu untersuchen. Wir haben vor kurzem berichtet, dass die intracerebroventricular (i.c.v.) Injektion von RTX hemmt die analgetische Wirkung von Acetaminophen bei Mäusen, was auf supraspinal-selektive TRPV1-Desensitisierung19hindeutet. In diesem Manuskript stellen wir das genaue Protokoll für die i.c.v. Injektion und nachfolgende Schmerztests vor.
Direkte Injektion von Medikamenten in die Herzkammern des Gehirns macht es möglich, ihre zentralen Effekte zu studieren, während alle peripheren Effekte zu minimieren. Das hier vorgestellte i.c.v. Injektionsverfahren ist eine Modifikation der von Haley und McCormick20berichteten Methode. Dieses Verfahren ist einfach mit dem Einsetzen einer Injektionsnadel in die seitlichen Ventrikel durch die koronale Naht und erfordert keine spezielle Ausrüstung oder chirurgische Verfahren für die Cannulation.
Periphere lokale Anwendung von TRPV1 Agonisten evoziert ein brennendes Schmerzempfinden und neurogene Entzündung. Mäuse, die systemisch mit RTX und TRPV1-KO-Mäusen behandelt werden, sind unempfindlich gegen diese Stimulation13. Wir haben eine intraplantare Injektion von RTX (RTX-Test) durchgeführt, um die Erhaltung des peripheren TRPV1 in RTX-i.c.v. zu bestätigen. Mäuse. Bei dieser Methode handelt es sich um eine Modifikation des konventionellen Formaltests21.
Es wurde berichtet, dass Mäuse, die systemisch mit RTX- und TRPV1-KO-Mäusen behandelt wurden, eine normale Schwelle zu mechanischen Reizen zeigen11,13,22. Hier stellen wir ein Verfahren für den Enddrucktest zur Prüfung von Veränderungen der schmerzstillenden Wirkung von Acetaminophen vor.
Alle diese Verfahren sind orthodox und vielseitig, und kann auf Studien von anderen Drogen angewendet werden.
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Protokoll
Alle hier verwendeten experimentellen Protokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der Musashino University genehmigt. Männliche ddY-Mäuse (SLC, Shizuoka, Japan) wurden mindestens 7 Tage lang unter einem 12-h-Licht-/Dunkelzyklus gehalten, bevor Experimente mit Wasser und Nahrung ad libitum durchgeführt wurden. Für die Experimente wurden 5- oder 6-wochen-alte Mäuse verwendet.
1. Zubereitung von Drogen
-
Rtx
HINWEIS: Alkoholische RTX-Lösung kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Achten Sie darauf, Gummihandschuhe und Brille nützen Sie bei der Handhabung. Diese Lagerlösung kann für 6 Monate verwendet werden.- Fügen Sie 500 l Ethanol auf 1 mg RTX hinzu.
- Fügen Sie der oben genannten Lösung 500 l Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonooleat hinzu und wirbeln Sie gut.
- 4 ml physiologische Salzin in die Mischung geben und gut wirbeln.
- Aliquot 40 l der Lösung in 1,5-ml-Schraubverschlussrohre einundlassen und bei -40 °C lagern.
-
Paracetamol
- Fügen Sie 20% w/v Propylenglycol-Lösung zu Acetaminophen in einer Konzentration von 30 mg/ml hinzu und lösen Sie sich mit einem Beschallungsmittel auf. Da Acetaminophen bei Raumtemperatur mehrere Stunden nach Auflösung ausfallen kann, bereiten Sie sich kurz vor Gebrauch vor oder halten Sie die Lösung warm, bis sie verwendet werden.
2. Subkutane oder Intracerebroventritrikuläre Injektion von RTX
- Tauen Sie die bestückte Lösung in 1.1 vorbereitet. und verdünnen Sie sie auf 20 g/ml in Salin- oder künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), bestehend aus (in mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 Glukose, 1,3 MgSO4, 2.5 CaCl2 gleichbei 95% O2 und 5% CO2 (pH 7,2).
- Anästhesisieren Sie Mäuse mit Pentobarbital-Natriumsalz (60 mg/kg, intraperitoneal), und überprüfen Sie auf Verlust des Rechtenreflexes.
- Zur s.c. Behandlung RTX (20 g/ml) in den Nacken mit einem Volumen von 0,1 ml/10 g Körpergewicht injizieren. Für die Kontrollgruppe das Fahrzeug (10% Ethanol, 10% Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonooleat und 80% Saline) auf die gleiche Weise injizieren.
- Zur i.c.v.-Behandlung 5 l RTX (20 g/ml) in den rechten seitlichen Ventrikel injizieren. Für die Kontrollgruppe das Fahrzeug (10% Ethanol, 10% Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonooleat und 80% ACSF) auf die gleiche Weise injizieren.
- Passieren Sie eine Einweg-27-G-Nadel durch ein Metallrohr (0,8 mm I.D.), um die 3,0-3,5 mm-Spitze der Nadel freizulegen (Abbildung 1A).
- Desinfizieren Sie den Kopf der Maus mit 70% Alkohol, und halten Sie die squamosalen Knochen der Maus fest mit den Fingern (Abbildung 1B).
HINWEIS: Achten Sie auf die Positionen der squamosalen Vorsprünge, da diese Vorsprünge als Richtungspunkte für die Injektion dienen. - Bewegen Sie die Nadel seitlich auf der Kopfhaut, und finden Sie die sagittale Naht, wie die Nadelspitze an der Naht eingehängt ist.
- Bewegen Sie die Spitze etwa 1 mm nach rechts, bewegen Sie dann die Spitze rostral, und finden Sie die koronare Naht wie bei 2.4.3. (Abbildung 1B).
- Setzen Sie die Nadel langsam und vertikal ein, injizieren Sie die RTX-Lösung in etwa 10 Sekunden und halten Sie sie etwa 10 Sekunden lang.
- Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, und bringen Sie die Maus in ihren Heimischenkäfig zurück. Blutungen sind in der Regel minimal oder fehlen. Wenn größere Blutungen auftreten, sollte die Verwendung einer anderen Maus in Betracht gezogen werden.
- Weisen Sie die vorbehandelten Mäuse als Subjekte für den RTX-Test oder den Enddrucktest zu (Schritt 3 bzw. 4).
3. RTX-Test
HINWEIS: Die Tests werden zwischen 10:00 Uhr und 17:00 Uhr durchgeführt. Der Prüfraum wird bei 200 Lux und 24-26 °C gehalten.
- Eine Woche nach der Vorbehandlung mit RTX (Schritt 2.) bringen Sie Mäuse mindestens 60 min vor Beginn des Tests in den Testraum.
- Wägen und legen Sie jede Maus einzeln in einen Plexiglaskäfig (29,5 x 17,5 x 13,5 cm3 Höhe) mindestens 30 min vor Beginn des Tests, damit sie sich an die Umwelt akklimatisieren kann.
HINWEIS: Die Reihenfolge der Tests sollte über die Vorbehandlungsgruppen hinweg ausgeglichen werden. - Acetaminophen (300 mg/kg) vor dem Test intraperitoneal an die Maus verabreichen.
- Halten Sie die Maus locker in einem kleinen Stoffbeutel, und legen Sie eine 30-Spur-Nadel in die Ferse der rechten Hinterpfote. Fördern Sie die Nadel subkutan in die Nähe der Gehpads, und injizieren Sie 20 l RTX-Lösung (0,05 g/ml).
- Messen Sie die Periode des Leck-/Beißens-Verhaltens im glabrous-Bereich der betroffenen Pfote in jedem 5-min-Block.
4. Schwanzdruckprüfung
HINWEIS: Zur Beurteilung der Schwelle für akute mechanische Nozieption wird ein Druckmessgerät vom Typ Randall-Selitto verwendet. Die Tests werden zwischen 10:00 Uhr und 17:00 Uhr durchgeführt. Der Prüfraum wird bei 200 Lux und 24-26 °C gehalten.
- Eine Woche nach der Vorbehandlung mit RTX (Schritt 2.) bringen Sie Mäuse in den Testraum und wiegen und legen Sie jede Maus einzeln in einen Plexiglaskäfig.
- Markieren Sie die Flecken auf 1,5 und 2,5 cm von der Basis des Schwanzes.
- Halten Sie die Maus locker in einem kleinen Stoffbeutel, und drücken Sie mit einer stumpfen Sonde auf die Stellen.
HINWEIS: Zur Vermeidung von Gewebeschäden wird ein Grenzdruck von 250 g auferlegt. - Bestimmen Sie den Druck, der erforderlich ist, um Fluchtverhalten auszulösen (Schwanzbeschwören, Verdrehen und Quietschen), und berechnen Sie die Nozizeptive Schwelle, indem Sie den an den beiden Stellen ermittelten Druck mittelisieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.3. bis 4.4. alle 15 Min.
- Nach Erhalt der Ausgangsbasis Acetaminophen (300 mg/kg) intraperitoneal an die Maus verabreichen. Wiederholen Sie nach der Verabreichung die Schritte 4.3. und 4,4 alle 15 Min.
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Ergebnisse
Die i.c.v.-behandelten Mäuse zeigen keine offensichtlichen Anomalien in ihrem Aussehen, spontanen Aktivitäten, Körpergewicht19 und Körperkerntemperatur (Fahrzeugbehandelte Gruppe, 38,4 x 0,3 °C, n = 6; RTX-behandelte Gruppe, 38,7 bei 0,2 °C, n = 6).
Abbildung 2A-B zeigt die Reaktionsfähigkeit von s.c.- oder i.c.v.-behandelten Mäusen auf die intraplantaare Inj...
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Diskussion
Der wichtigste Schritt in diesen Experimenten ist der Erfolg der i.c.v. Injektion. Die hier verwendete i.c.v. Injektionstechnik ist recht einfach, erfordert aber einige Übung. Vor Experimenten wird das Üben mit Farbstoffen (z.B. 0,5% Trypanblau in Derinin) empfohlen. Wenn die Injektion korrekt durchgeführt wird, sollte eine Nadelmarkierung an der koronalen Naht und der injizierte Farbstoff in der kontralateralen Herzkammer und der dritten Herzkammer vorhanden sein. Darüber hinaus sollte das eineinsetzen während der Injek...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Resiniferatoxin | LKT Laboratories | R1774 | für s.c./i.c.v.-Vorbehandlungen und den RTX-Test verwendet |
| Paracetamol | IWAKI SEIYAKU | geschenkt von IWAKI SEIYAKU | |
| Pentobarbital-Natriumsalz | Tokyo Chemical Industry | P0776 | für die Anästhesie |
| Ethanol (99,5) | Wako Pure Chemical Industries | 057-00456 | zum Auflösen von RTX |
| Polyoxyethylen(20)-Sorbitan-Monooleat | Wako Pure Chemical Industries | 161-21621 | zum Auflösen von RTX |
| 25 μ L Mikrospritze | Hamilton | 1702LT | zur i.c.v. Injektion |
| 100 μ L-Mikrospritze | Hamilton | 1710LT | für die intraplantare Injektion |
| 26-Gauge-Einwegnadel | TERUMO | NN-2613S | für die intraplantare Injektion |
| 30-Gauge-Einwegnadel | NIPRO | 01134 | für die intraplantare |
| Injektion Druckmessgerät | Ugo Basile | Analgesy-Meter Typ 7200 | für die Enddruckmessung |
Referenzen
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