Decellularization af hele den menneskelige hjerte indeni en trykisoleret pose i en inverteret orientering
Summary
Denne metode giver mulighed for decellularization af en kompleks solid orgel ved hjælp af en enkel protokol baseret på osmotisk chok og perfusion af Ioniske vaskemiddel med minimal orgel matrix forstyrrelser. Det består af en roman decellularization teknik til menneskers hjerter inde en trykisoleret pose med real-time overvågning af flow dynamics og cellular vragdele udstrømning.
Abstract
Den ultimative løsning til patienter med slutstadiet hjertesvigt er organtransplantation. Men donor hjerter er begrænset, immunosuppression er påkrævet, og i sidste ende afvisning kan forekomme. At skabe en funktionel, kunne autolog bio-kunstige hjerteklapper løse disse udfordringer. Biofabrication af et hjerte består af stillads og celler er en mulighed. En naturlig stillads med væv-specifikke sammensætning samt mikro – og makro-arkitektur kan fås ved decellularizing hjerter fra mennesker eller store dyr som grise. Decellularization indebærer udvaskning celleaffald samtidig bevare 3D ekstracellulære matrix og vaskulatur og så “cellularization” på et senere tidspunkt. Kapitalisering på vores roman at finde denne perfusion decellularization af komplekse organer er muligt, vi udviklet en mere “fysiologisk” metode til at decellularize ikke-ender menneskers hjerter ved at placere dem inde i et trykisoleret pose, i et omvendt orientering, under kontrollerede pres. Formålet med ved hjælp af en trykisoleret pose er at skabe pres forløb på tværs af aortaklappen at holde det lukket og forbedre Myokardie perfusion. Samtidige vurdering af flow dynamics og celleaffald fjernelse under decellularization tillod os at overvåge både væske tilstrømning og debris udstrømning, derved skabe et stillads, der kan anvendes enten til simple hjerte reparation (f.eks. som en patch eller ventil stillads) eller som en helhed-orgel stillads.
Introduction
Hjertesvigt fører til høj dødelighed hos patienter. Den ultimative behandlingsmulighed for slutstadiet hjertesvigt er allo-transplantation. Men der er en lang ventetid-liste for transplantation på grund af manglen på donor organer, og patienter ansigt efter transplantation hæk der spænder fra livslang immunosuppression til kronisk orgel afvisning1,2. Bioteknologi funktionelle hjerter af genopretning decellularized menneskelig størrelse hjerter med en patients egne celler kunne omgå disse forhindringer3.
Et stort skridt i “manipulation” et hjerte er oprettelsen af et stillads med passende kar og parenkymalt struktur, sammensætning og funktion til at guide tilpasningen og organisering af leverede celler. Tilstedeværelse af en passende ramme, bør celler seedede på skafottet genkende miljøet og udføre den forventede funktion som medlem af dette organ. I vores udtalelse består decellularized orgel ekstracellulære matrix (dECM) de nødvendige Karakteristik af det ideelle stillads.
Ved at udnytte iboende Vaskulaturen, kan komplekse hele-orgel decellularization opnås via antegrad eller retrograd perfusion4 til at fjerne blodlegemers samtidig bevare delikat 3D ekstracellulære matrix og Vaskulaturen2, 5,6,7. En funktionel Vaskulaturen er vigtigt i bioteknologi hele organer netop som det er i vivo, næringsstof i distributionen og bortskaffelse8. Koronar perfusion decellularization har vist sig for at være effektiv i at skabe decellularized hjerter fra rotter4eller svin4,7,9,10,11 ,12,13, og mennesker5,7,14,15,16. Endnu, integriteten af ventilerne, forkamre og andre “tynde” områder kan lide.
Human-størrelse decellularized hjerte stilladser kan fås fra svin ved hjælp af pres kontrol7,9,10,11,12 eller infusion flow sats kontrol13, 17 og fra menneskelige donorer ved hjælp af pres styre5,7,14,15. Decellularization af menneskelige donor hjerter sker over 4-8 dage under pres kontrolleret på 80-100 mmHg i opretstående orientering5,15,16 eller over 16 dage under pres kontrolleret på 60 mmHg14 . Under antegrad, pres-kontrollerede decellularization, spiller aortaklappen kompetence en afgørende rolle i at opretholde koronar perfusion effektivitet og stabil trykket i aorta-roden. Vores tidligere arbejde afslørede, at orienteringen af hjertet påvirker dens koronar perfusion effektivitet under decellularization proceduren og derfor stillads integritet i slutningen9.
Som en fortsættelse af vores tidligere arbejde9introducerer vi en roman koncept, hvori en hjertesækken-lignende pose er tilføjet for at forbedre hele-hjerte decellularization. Vi beskriver decellularization af menneskelige hjerter placeret inde trykisoleret poser, omvendt orienterede, og under pres kontrolleret på 120 mmHg aorta-roden. Denne protokol omfatter overvågning flow profil og samling af udstrømning medierne i hele decellularization proceduren til at evaluere koronar perfusion effektivitet og celle debris fjernelse. Biokemiske analyser udføres derefter for at teste effektiviteten af metoden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til vores viden er dette den første undersøgelse at betænkningen inverteret decellularization af menneskelige hjerter inde en trykisoleret pose med time-lapse overvågning af flow sats og celle debris fjernelse. At hjertesækken-lignende pose holder retningen af hjertet stabile i hele decellularization proceduren. Sænkes ned og vende hele hjerte indeni en pose forhindrer dehydrering og minimerer for stor belastning af aorta (fra hjertet vægt) Hvornår i forhold til de konventionelle oprejst Langendorff perfusion dec…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Houston Endowment grant og Texas Emerging Technology Fund. Forfatterne anerkender agenturets orgel indkøb LifeGift, Inc. og donors familier for at gøre denne undersøgelse mulig.
Materials
| 2-0 silk suture | Ethicon | SA85H | Suture used to ligate superior and inferior vena cava |
| 1/4" x 3/8" connector with luer | NovoSci | 332023-000 | Connect aorta and pulmonary artery |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing | Cole-Parmer | HV-96410-16 | Tubing to connect heart chambers/veins |
| infusion and outflow line | Smiths Medical | MX452FL | For flowing solutions through the vasculature |
| Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches) | Fisher scientific | 01-812-17 | Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization |
| Snapware Square-Grip Canister | Snapware | 1022 | 1-liter Container used for perfusing heart |
| Black rubber stoppers | VWR | 59586-162 | To seal the perfusion container |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | 881003 | To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids |
| 2 L aspirator bottle with bottom sidearm | VWR | 89001-532 | For holding solutions/perfusate |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | Life Technologies | P7589 | For quantifying dsDNA |
| Calf thymus standard | Sigma | D4522 | DNA standard |
| Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit | Biocolor Ltd | Blyscan #B1000 | GAG assay kit |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 Pro | For analytical assays |
| GE fluoroscopy | General Electric | OEC 9900 Elite | Angiogram |
| Visipaque | GE | 13233575 | Contrast agent |
Referenzen
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Zia, S., et al. Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation. Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).
- Zimmermann, W. H. Strip and Dress the Human Heart. Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: Using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).
- Sanchez, P. L., et al. Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts. Biomaterials. 61, 279-289 (2015).
- Peloso, A., et al. Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering. Stem Cell Research & Therapy. 6, 107 (2015).
- Guyette, J. P., et al. Perfusion decellularization of whole organs. Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).
- Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis. Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).
- Lee, P. F., et al. Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts. Acta Biomaterialia. , (2016).
- Momtahan, N., et al. Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Weymann, A., et al. Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model – Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds. Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).
- Weymann, A., et al. Bioartificial heart: A human-sized porcine model–the way ahead. PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).
- Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion. Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).
- Guyette, J. P., et al. Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix. Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).
- Sanchez, P. L., et al. Data from acellular human heart matrix. Data Brief. 8, 211-219 (2016).
- Garreta, E., et al. Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts. Biomaterials. 98, 64-78 (2016).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart. Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Larson, A. M., Yeh, A. T. Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses. Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).
- Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices. Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).
- Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness. Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).
- Wu, Z., et al. Multi-photon microscopy in cardiovascular research. Methods. 130, 79-89 (2017).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Murthy, V. L., et al. Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC. Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal organ weights in men: Part I-the heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).
- Molina, D. K., DiMaio, V. J. Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart. The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).
- Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix. PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).
- Robertson, M. J., Soibam, B., O’Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology. PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).
- Baghalishahi, M., et al. Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).
- Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
- Freytes, D. O., O’Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes. Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).
- Oberwallner, B., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
