在加压袋内以倒置方向对完整人类心脏进行脱细胞处理

摘要

该方法通过基于渗透冲击和离子型去污剂灌注的简单方案，实现对复杂实体器官的脱细胞处理，同时最大程度减少对器官基质的破坏。该技术包含一种新颖的人类心脏脱细胞方法，将心脏置于加压袋内，并对流动动力学和细胞碎片流出进行实时监测。

摘要

终末期心力衰竭患者的根本解决方案是器官移植。然而，供体心脏数量有限，且需要长期使用免疫抑制剂，最终仍可能发生排斥反应。构建具有功能的自体生物人工心脏有望解决上述难题。由支架和细胞组成的生物制造心脏是一种可行策略。通过脱细胞化人类或大型动物（如猪）的心脏，可以获得具有组织特异性成分以及微观和宏观结构的天然支架。脱细胞化过程旨在清除细胞碎片，同时保留三维细胞外基质和血管系统，以便在后续时间点进行"细胞重植"。基于我们的一项新发现——复杂器官可通过灌注方式进行脱细胞化，我们开发出一种更为"生理化"的方法，用于处理无法用于移植的人类心脏：将心脏倒置置于加压袋内，并在可控压力条件下进行操作。使用加压袋的目的是在主动脉瓣两侧形成压力梯度，使其保持关闭状态，从而改善心肌灌注。在脱细胞化过程中同步评估流体动力学变化和细胞碎片清除情况，可同时监测灌注液流入和碎片流出，由此制备出的支架既可用于简单的心脏修复（例如作为补片或瓣膜支架），也可作为完整器官的支架。

引言

心力衰竭导致患者的高死亡率。终末期心力衰竭的最终治疗选择是异体移植。然而，由于供体器官短缺，患者需要长时间等待移植，且移植后仍面临诸多障碍，包括终身免疫抑制和慢性器官排斥反应^1,2。通过将患者自体细胞重新接种到去细胞化的人类大小心脏支架上，以生物工程手段构建功能性心脏，有望克服这些障碍³。

一个关键步骤 "工程学" 心脏的构建需要具有适当血管和实质结构、组成及功能的支架，以引导所递送细胞的排列与组织。在具备合适框架的情况下，接种于支架上的细胞应能识别该微环境，并作为器官的一部分发挥预期功能。我们认为，脱细胞器官细胞外基质（dECM）具备理想支架所需的各项特性。

通过利用器官固有的血管系统，可通过顺行或逆行灌注实现复杂完整器官的脱细胞化⁴，从而在保留精细的三维细胞外基质和血管结构的同时去除细胞成分^2,5,6,7。功能性血管系统在组织工程完整器官中至关重要，其作用与体内in vivo相同，即实现营养物质输送和代谢废物清除⁸。冠状动脉灌注脱细胞化方法已被证实可有效制备大鼠⁴、猪^{4,7,9,10,11,12,13}以及人类^5,7,14,15,16的脱细胞心脏。然而，瓣膜、心房及其他"较薄"区域的结构完整性可能受到损害。

可通过压力控制^7,9,10,11,12或灌注流速控制^13,17从猪心脏获取人尺寸的脱细胞心脏支架，也可通过压力控制^5,7,14,15从人类供体心脏获取。人类供体心脏的脱细胞过程在直立位、80–100 mmHg压力控制条件下需4–8天^5,15,16，或在60 mmHg压力控制条件下持续16天¹⁴。在顺行性压力控制脱细胞过程中，主动脉瓣的功能完整性对于维持冠状动脉灌注效率及主动脉根部稳定的压力至关重要。我们先前的研究表明，心脏在脱细胞过程中的摆放方向会影响其冠状动脉灌注效率，从而最终影响支架的完整性⁹。

作为我们先前工作的延续⁹，我们提出了一种新概念，即添加一个类似心包的囊袋以改善全心脏脱细胞效果。我们描述了将人类心脏置于加压囊袋内、倒置定向，并在主动脉根部维持120 mmHg压力条件下进行脱细胞的过程。该方案包括在脱细胞过程中监测流动曲线并收集流出液，以评估冠状动脉灌注效率和细胞碎片清除情况。随后进行生化检测，以验证该方法的有效性。

方案

所有实验均遵循德克萨斯心脏研究所伦理委员会的指导方针。

1. 器官准备

注意：本研究与德克萨斯州的非营利性器官获取组织 LifeGift（http://www.lifegift.org）合作，使用经批准同意后不适合移植的捐赠人类心脏进行科研。

1. 获取心脏后，通过静脉输注 30,000 U 肝素至心脏。将心脏停跳液套管牢固缝合于主动脉，并连接夹闭的灌注管路。穿刺下腔静脉（IVC）以引流右心。剪开左上肺静脉或左心耳以引流左心腔。
2. 灌注 1 L 心脏停跳液或肝素化生理盐水。游离主动脉弓分支、上腔静脉（SVC）及其他肺静脉，使心脏脱离所有血管或周围组织连接。将充分肝素化的心脏浸入冰盐水中。
3. 检查供体人的心脏（包括前侧和后侧，图1）。将心脏置于解剖托盘上，检查是否存在结构损伤或解剖畸形。若同时获取了肝脏和/或肺脏用于移植，心脏可能出现下腔静脉较短和/或左心房后壁缺失的情况。
4. 进行内部检查，评估是否存在潜在缺陷——如房间隔缺损（ASD）、室间隔缺损（VSD）或瓣膜（主动脉瓣、肺动脉瓣、二尖瓣、三尖瓣）畸形。
5. 若存在间隔缺损，应使用适当缝线进行修补（图2A、2B）。修补间隔缺损是为了通过肺动脉（PA）流出道浊度测量来监测脱细胞进程。修补后可消除左向右分流，从而使PA流出代表冠状循环经冠状窦的流出情况。
6. 使用 2-0 丝线结扎上腔静脉和下腔静脉（图2C）。
7. 游离主动脉（Ao）与主肺动脉（PA）之间的组织（图2D），以便后续插管。
8. 根据血管直径选择合适的连接器（图3），插入主动脉（Ao）和肺动脉（PA），并用 2-0 丝线固定（图4A）。
9. 通过左心房插入导管（图4B），经由任一肺静脉开口进入左心室（LV）（图3）。
10. 将输注管路连接至主动脉（Ao）中的连接器，流出管路连接至肺动脉（PA）中的连接器（图3）。
11. 将准备好的心脏倒置（ upside down）放入聚酯袋中。
12. 将装有心脏的聚酯袋放入灌注容器中，并盖上盖子（图4C）。
13. 将各管路连接至橡胶塞上相应直径的接口（根据容器尺寸选择），并将橡胶塞插入灌注容器盖中，以密封聚酯袋（图4C 和 图5B）。
14. 通过橡胶塞上的灌注口灌注 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）（蒸馏水中含 136 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄ 和 1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4），验证肺动脉（PA）及插入左心室（LV）导管的流出情况。
15. 利用此流动清洗血管系统中残留的任何血液痕迹。若未观察到流动，应检查并收紧可能松动的连接管路。

2. 系统设置与器官脱细胞操作步骤

1. 组装生物反应器并将其置于直立位置（图5）。灌注系统包括一台个人计算机（PC）、比例-积分-微分（PID）控制器、用于主动脉（Ao）灌注的蠕动泵、灌注式生物反应器、用于左心室（LV）灌注液储存的压力头容器（2L 吸引瓶，底部带侧臂），以及另一台蠕动泵，用于从压力头容器中排出多余液体并收集肺动脉（PA）流出液。
2. 在橡胶隔膜上，将灌注管路、压力头管路、PA流出管路以及生物反应器排液管路连接至位于灌注生物反应器顶部的橡胶盖表面接口（图5A）。
3. 在主动脉根部维持恒定压力120 mmHg的条件下进行心脏脱细胞处理。在整个脱细胞过程中，左心室（LV）的平均压力应保持在14–18 mmHg范围内。
4. 按以下步骤进行心脏脱细胞处理：500 mM NaCl 高渗溶液处理4小时，20 mM NaCl 低渗溶液处理2小时，1% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液处理120小时，最后用120 L的1×磷酸盐缓冲液（PBS）进行终末冲洗（图6A）。
5. 在恒定压力控制（120 mmHg）下进行心脏脱细胞处理。主动脉（Ao）内的灌注流速因心脏而异，平均流速分别为：高渗溶液98.06±16.22 mL/min，低渗溶液76.14±7.90 mL/min，SDS溶液151.50±5.76 mL/min，PBS溶液185.24±7.10 mL/min。各试剂消耗总体积平均为：高渗溶液23.36±5.70 L，低渗溶液9.13±1.26 L。
6. 在SDS灌注结束前，循环使用最后60 L的1% SDS溶液（每克心脏重量使用1 L）。图6A展示了脱细胞过程的时间线，并标明了数据采集的关键节点：灌注期间监测主动脉（Ao）和肺动脉（PA）的流速，以及从压力头容器收集PA和非PA流出液。
7. 由于上腔静脉（SVC）和下腔静脉（IVC）已被结扎，可合理推断从肺动脉（PA）收集到的所有液体均来源于实际的冠状动脉灌注（图5B）。通过将PA流出灌注液的流速除以Ao输入溶液的流速，直接计算冠状动脉灌注效率：
   冠状动脉灌注效率 = （%）。
8. 将来自PA和LV的灌注液以及输入溶液分别取200 μL加入透明底96孔板中，每组设两个复孔，于280 nm波长下测定吸光度，进行比较分析。该吸光度值经经验筛选后确定，可提供最佳的归一化结果。
9. 以洁净输入试剂的浊度作为对照。流出灌注液的浊度反映细胞碎片的洗脱情况，可在脱细胞过程中实时量化，作为过程追踪工具。
10. 在最后使用10 L的1×PBS进行冲洗时，加入500 mL经10N NaOH中和的无菌2.1%过氧乙酸溶液，使PBS中过氧乙酸终浓度为0.1%（v/v），用于支架的灭菌处理。

3. 脱细胞心脏的评估

注意：脱细胞后，将使用代表性心脏进行冠状动脉造影成像和生化检测。

1. 对代表性去细胞化人心脏进行冠状动脉造影，以检查冠状血管系统的完整性。简言之，通过右冠状动脉和左冠状动脉主干的冠状动脉口插管注入造影剂后，在荧光透视镜下对去细胞化人心脏进行成像。
2. 解剖去细胞化心脏，从19个区域获取组织样本，以评估去细胞化组织中残留的脱氧核糖核酸（DNA）、糖胺聚糖（GAG）和十二烷基硫酸钠（SDS）水平。将心底部从心室分离，并将心室分为4个相等的部分（图6C）。将每个部分进一步分为前、后右心室（RV）、前、后左心室（LV）以及室间隔（IVS）。包含心尖的组织在取样时分别归入左心室和右心室。
3. 切取用于DNA、GAG和SDS检测的组织样本（湿重约15 mg）。
4. 通过在1 M NaOH中65 °C消化3小时提取双链DNA（dsDNA），并使用10x Tris-EDTA（TE）缓冲液和1 M盐酸（HCl）将pH调节至7。
5. 使用含小牛胸腺DNA标准品的双链DNA检测试剂盒定量dsDNA（见材料表）。采用荧光酶标仪对样本进行双复孔检测（激发波长480 nm，发射波长520 nm）。通过比较各组织样本中dsDNA浓度与尸体来源心脏组织的dsDNA浓度，计算去细胞化心脏中残留dsDNA的百分比（% 尸体来源）。
6. 将组织样本在木瓜蛋白酶提取液（含0.2 M磷酸钠缓冲液、EDTA二钠盐、盐酸半胱氨酸、乙酸钠和木瓜蛋白酶）中65 °C孵育3小时，使硫酸化糖胺聚糖（GAG）溶解释放。使用糖胺聚糖检测试剂盒对GAG含量进行双复孔测定。
7. 将用于SDS检测的样本在加热真空条件下冻干，并测定干重。向每份干燥样本中加入200 µL超纯水，匀浆以将残留SDS溶解释出。将所得SDS溶液与氯仿及亚甲蓝溶液（1 L含12 mg亚甲蓝的0.01 M HCl溶液）混合。SDS将与亚甲蓝染料结合并转移至有机相。
8. 使用荧光酶标仪在655 nm波长下对标准品和样本进行双复孔吸光度检测，计算残留SDS含量，并将该SDS数值归一化至组织干重。
9. 利用非线性光学显微镜（NLOM）对人心脏厚壁区域（即左心室、右心室和室间隔）的样本进行成像，以确认去细胞化后细胞的去除情况。NLOM系统的具体配置详见我们此前的发表文献^18,19,20。NLOM可通过双光子荧光（TPF）和二次谐波生成（SHG）通道，在无需任何外源性染料或染色剂的条件下，对细胞、弹性蛋白、胶原蛋白和肌球蛋白纤维进行成像²¹。

结果

在以120 mmHg恒定压力通过顺行主动脉灌注进行为期7天的脱细胞处理后，人的心脏变为半透明状（图6B）。将心脏大体解剖为19个部分，用于生化分析（DNA、GAG和SDS）（图6C），以评估最终的脱细胞产物。

在整个脱细胞过程中，由于压力保持恒定，不同溶液的灌注流速随之变化。进入主动脉的流速（Ao）图7A) 随灌注液从高渗转变为低渗，灌注流速逐渐从 96.68±23.54 降至 80.59±12.41 mL/min（下降 16.64%）。相反，当灌注液从低渗转变为 SDS 时，流速从 71.68±10.63 增至 110.61±14.40 mL/min（增加 54.31%）。在 SDS 灌注期间，灌注流速在 110±14.40 至 176.31±44.03 mL/min 之间...

讨论

据我们所知，这是首项报道在加压袋内对人类心脏进行倒置脱细胞处理，并对流速和细胞碎片清除过程进行延时监测的研究。类似心包膜的袋状结构在整个脱细胞过程中保持了心脏方向的稳定性。将完整心脏浸没并倒置置于袋内，与传统的直立式Langendorff灌注脱细胞方法相比，可防止脱水，并显著减少心脏重量对主动脉造成的过度张力⁹。这进而保护了主动脉瓣的功能完整性。

为了实现最大程度的脱细胞效率，冠状血管阻力必须保持较低，以确保液体能够充分且稳定地灌注整个心肌组织。在采用逆行灌注的全心脏脱细胞模型中，液体会在心室中积聚，导致心室内压力升高，进而增加冠状血管阻力并限制液体流动。即使主动脉瓣结构完整，心室腔仍会因生理性的渗漏而充液，从而压迫心室壁。

在加压袋内对心脏进行脱细胞的技术旨在缓解这一问题，并提高脱细胞效率。脱细胞过程中，主动脉根部维持120 mmHg的压力，袋内维持14 mmHg的压力。这些压力值接近生理范围（主动脉压力为80–120 mmHg，左心室舒张末期压力为15 mmHg）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-0 丝线缝合线	Ethicon	SA85H	用于结扎上腔静脉和下腔静脉的缝合线
1/4" x 3/8" 带鲁尔接头的连接器	NovoSci	332023-000	连接主动脉与肺动脉
Masterflex 铂金固化硅胶管	Cole-Parmer	HV-96410-16	用于连接心腔或静脉的导管
灌注与流出管线	Smiths Medical	MX452FL	用于使溶液流经血管系统
聚酯袋（Ampak 400 系列 SealPAK 袋）	Fisher scientific	01-812-17	模拟心包膜的袋子，用于脱细胞过程中容纳心脏
Snapware Square-Grip 密封罐	Snapware	1022	1 升容器，用于心脏灌注
黑色橡胶塞	VWR	59586-162	用于密封灌注容器
蠕动泵	Harvard Apparatus	881003	用于通过流入管线泵送液体并排出废液
2 L 带侧臂底部的抽吸瓶	VWR	89001-532	用于盛放溶液或灌注液
Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒	Life Technologies	P7589	用于定量双链 DNA
小牛胸腺 DNA 标准品	Sigma	D4522	DNA 标准品
Blyscan 糖胺聚糖（GAG）检测试剂盒	Biocolor Ltd	Blyscan #B1000	GAG 检测试剂盒
酶标仪	Tecan	Infinite M200 Pro	用于分析检测
GE 透视成像系统	General Electric	OEC 9900 Elite	血管造影
Visipaque	GE	13233575	造影剂