Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

Chimeric Antigen-Rezeptor (Auto) T-Zell-Therapie ergab erstaunliche klinische Erfolge bei der Behandlung von CD19⁺ Malignome führt zur Genehmigung des Tisagenlecleucel für Stammzelltransplantation akute lymphoblastische Leukämie¹ und Axicabtagene Ciloleucel für progressive große B-Zell non-Hodgkin-Lymphom² im Jahr 2017.

Die Bedeutung der Wechselwirkungen zwischen Krebs und das Immunsystem im Krankheitsverlauf und therapeutischen Mechanismen gewinnt zunehmend anerkannte^3,4,5. Zum Beispiel ist es gut dokumentiert, dass der Tumor Mikroumgebung (TME) überflutet mit Faktoren, die die Effektor-Funktionen von Immunzellen^6,7,8unterdrücken können. Alternativ kann grundieren der körpereigenen Immunzellen und Epitop Verbreitung Schlüssel im Tumor Ausrottung und langfristige Beständigkeit gegen Tumor Challenge^9,10sein. Beide dieser Phänomene können in xenogene Modelle ausgewertet werden, die ein immunes System fehlt. Auch spiegeln Systeme mit Hilfe transgener Proteine genau nicht die Herausforderung des Brechens Immuntoleranz für erforderliche Epitop Verbreitung^11,12. Ein Phänomen Modell mit einem voll funktionsfähigen Immunsystem ist daher von größter Bedeutung für die Modellierung von diese wichtigen Aspekte der Krankheit fortschreiten und Immune Krebstherapeutika.

Eine wichtige Einschränkung der Auto T-Zell-Therapie ist, dass Lymphodepleting Vorbehandlung für Therapieerfolg^13,14erforderlich ist. Dies geschieht in der Regel bei Patienten durch die Verabreichung der Chemotherapie vor der Infusion von CAR T Zellen^15,16. Als standard-Methode um Lymphodepletion verwendet, in der Patienten-Einstellung zu imitieren verabreichen wir 5 Gy-Ganzkörper-Bestrahlung (TBI), Lymphodepletion vor der Verabreichung der therapeutischen Auto T-Zellen in Mäusen mit systemischen A20 B-Zell-Lymphom zu erreichen.

Lymphodepleting Vorbehandlung ist, zwar kein Problem für die meisten Patienten heißt Toxizität, die im Lieferumfang von Chemotherapeutika Patienten niedrige Performance-Status Auto T-Zell-Therapie nicht zusteht. Erstellen Sie ein Testsystem, das die Patienten nicht für eine Lymphodepletion darstellt, haben wir ein Lymphoreplete Phänomen Mausmodell, in dem wir Auto T-Zell-Therapie von Lymphomen Modell, etabliert. In diesem Modell zeigten wir, dass die Sekretion von IL-12 aus im Auto T-Zellen zu Beseitigung der etablierten Lymphom mit einer Erfolgsquote von ~ 25 %¹⁷. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass körpereigene Immunzellen bei der Beseitigung der Krebs beteiligt waren.

Hier beschreiben wir ausführlich das Protokoll für die Herstellung von Maus Auto T-Zellen, Lymphom in Phänomen Mäuse und Behandlung von Lymphomen mit Auto-T-Zellen mit oder ohne den Einsatz von Lymphodepleting Vorkonditionierung etablieren. Dies kann für Kombination Studien von Auto-T-Zellen mit anderen Agenten, Test Auto T-Zellen mit anderen transgene oder die Verwendung anderer Adoptiveltern Zelle Therapie oder Immuntherapie Strategien gegen Lymphom verwendet werden.

Alle Tierversuche wurden unter der Schirmherrschaft der Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act 1986 und UK Coordinating Committee für Krebsforschung Richtlinien durchgeführt. Alle Tierversuche durchgeführt am Institut CRUK-Manchester und genehmigt durch die lokalen Tierschutz und Ethik überprüfen Körper (CRUK-MI-AWERB).

1. Vorbereitungen

1. Maxiprep pMP71 retrovirale konstruieren Plasmid und pCL-Eco Retrovirus Verpackung Plasmide¹⁸.
   Hinweis: pMP71 kodiert, mCherry und das Auto durch eine FMDV2A Sequenz getrennt. Dies ist austauschbar mit anderen retroviralen Konstrukten. pCL-Eco kodiert Gag, Pol und die Ecotropic Umschlag Proteine.
2. Bereiten Sie komplette T-Zell-Medium (TCM) für die Kultivierung von Maus-T-Zellen mit RPMI 1640 Medium, 10 % FCS, 1 % 100 X Penicillin-Streptomycin-Glutamin (PSG).
   Hinweis: Die Lösung enthält 100 IE/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin und 2 mM L-Glutamin), 50 μM β-Mercaptoethanol und 25 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES).
3. Kulturzellen Sie A20 in RPMI 1640, 10 % FCS und 0,05 mM β-Mercaptoethanol bei 37 ° C, 5 % CO₂.
4. Kultur der Platin-E (Plat-E) Zellen in komplette Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) (DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 2 mM L-Glutamin, 1 μg/mL Puromycin und 10 μg/mL Blasticidin) bei 37 ° C, 5 % CO_2.
   Hinweis: Plat-E Zellen stammen aus 293T Zellen und express Gag, Pol und Ecotropic Umschlag retrovirale Proteine.
5. Bereiten Sie Transfektion Medienlösungen 1 und 2 unmittelbar vor Transfektion. Bereiten Sie Lösung 1 (pH 7,9) enthalten DMEM + 10 % FCS + 25 mM HEPES, Lösung 2 (pH 7,1) enthalten DMEM + 25 mM HEPES vor.
6. Bereiten Sie 10 μg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment Lösung durch Verdünnung mit sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und bei-20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
7. Steril alle Filtermedien durch 0,2 μm-Filter vor der Verwendung (ausgenommen rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment).

(2) retrovirale Transduktion von T-Zellen

1. Tag 1: Vorbereitung zur Transfektion
   1. Samen 7,5 x 10⁶ Platin-E (Plat-E) Zellen in 15 cm² Gewebekultur Gerichte in 18 mL komplette DMEM und Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂.
2. 2. Tag: Transfektion von Plat-E retrovirale Verpackung Zelllinie
   1. Bereiten Sie 20.4 μg des Pcl-Eco Verpackung Vektor-DNA, 39,6 µg Plasmid-DNA Kodierung retrovirale Auto Konstrukt und 150 μL 1 M CaCl₂ zu Endvolumen von 3 mL Transfektion Lösung 2 je 15 cm² Teller transfiziert werden vor. Wirbel für 10 s und 5 min ruhen lassen
   2. Die 15 cm² Gerichte DMEM Medien entnehmen und ersetzen mit 12 mL Transfektion Lösung 1.
      Vorsicht Wenn die Medien verändert, können die 15 cm² Gerichte in der Mitte trocknen. Dadurch können erhebliche Tod von transfizierten Zellen Plat-E. Arbeiten Sie zügig und entfernen Sie Medien von nur 1-2 Platten zu einem Zeitpunkt zu.
   3. Fügen Sie 3 mL Transfektion Lösung 2 mit DNA und CaCl₂ um jeweils 15 cm² Teller tropfenweise, gleichmäßig auf jeder Platte. Schütteln Sie Platten mit einer Seite zur anderen Bewegung für 10 S. Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂ über Nacht.
3. Tag 3: Vorbereitung der Virus-haltigen überstand für die Transduktion
   1. Ersetzen Sie die Medien von transfizierten Zellen der Platte-E mit 18 mL komplette TCM zurück zum Inkubator.
      Vorsicht Wenn wechselnde Medien 15 cm² Gerichte in der Mitte trocknen kann. Dadurch können erhebliche Tod von transfizierten Zellen Plat-E. Arbeiten Sie zügig und entfernen Sie Medien von nur 1-2 Platten zu einem Zeitpunkt zu.
4. Tag 3: Isolierung und in-vitro- Aktivierung der Milz T Mauszellen.
   1. 6-8-Woche-alten BALB/c Mäuse wie oben beschrieben durch Parkinson Et Al. entfernen Sie Milz ¹⁹ und tauche sie in sterile, eiskalt, PBS in einer 50 mL konische Röhre.
   2. Benutzen Sie eine Pinzette Milz auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen und mit einem Stößel mit minimalem Kraftaufwand zu homogenisieren.
   3. Verwenden eine 1000 μl Pipette und ~ 800 μl PBS übertragen Homogenat auf einem 100 μm Pore Zelle Sieb angebracht, um eine 50 mL-Tube mit 5 mL PBS, eine einzelne Zelle Aussetzung zu erreichen. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2 für zusätzliche Milz. Überschreiten Sie 3 Milz pro Röhre nicht.
      Vorsicht Splenocyten Filter durchlaufen können Klumpen bilden, bleibt stehen. Manuell schwenken Röhren zeitweise wenn mehrere Milz zur Vermeidung von Zelle Verklumpung zu verarbeiten. Verbleibenden Fragmente auf der Zelle-Sieb kann weiter mit einem Kolben aus einer 5 mL Spritze mit minimalem Kraftaufwand püriert werden.
   4. Top-bis zu 20 mL mit PBS. Schicht der 20 mL Zellsuspension sanft auf 20 mL Dichte Gradienten Medien (Table of Materials) in einem 50 mL-Tube. Zentrifugieren Sie die daraus resultierenden überlagerte Aussetzung bei 800 X g für 20 min mit keine Bremse.
   5. Zellen mit einem sterilen Pasteurpipette und Transfer in ein 50 mL-Tube-Schnittstellenschicht zu ernten. Top-bis zu 50 mL mit PBS und Zentrifuge bei 800 X g für 10 min waschen. Verwerfen Sie den überstand und erneut aussetzen Sie Zellen in der kompletten TCM.
   6. Die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.
   7. Kulturzellen bei einer Dichte von 5 x 10⁶ Zellen/mL in der kompletten TCM mit 30 ng/mL Anti-CD3ε Antikörper (Klon 145-2 C 11), 30 ng/mL Anti-CD28 Antikörper (Klon 37,51), 100 U/mL rekombinanten menschlichen Il-2 und 2 ng/mL rekombinante murine IL-7. Verwenden Sie eine entsprechend dimensionierte Gewebekultur Kolben für das Volumen der Zellen geerntet.
      Hinweis: –Antigenpräsentierende Zellen sind erforderlich für den T-Zell-Aktivierung von CD3 und CD28 Antikörper, wenn arbeiten mit gereinigten T Zellen es Mantel Platten mit Antikörpern erforderlich ist, oder verwenden Sie magnetische Beads (Table of Materials)
   8. Inkubieren Sie Maus splenocyten bei 37 ° C, 5 % CO₂ über Nacht.
5. Tag 3: Vorbereitung der Platten für die Transduktion
   1. Mantel-Gewebekultur 6-Well-Platten mit 2 mL 10 μg/mL rekombinanten menschlichen Fibronektin fragmentieren und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
6. 4. Tag: Transduktion von Maus-T-Zellen
   1. Übertragen Sie rekombinante menschliche Fibronektin Fragment von beschichteten Platten auf frischen Gewebekultur 6-Well-Platten. Inkubieren Sie diese Platten über Nacht bei 4 ° C für Runde 2 der Transduktion.
   2. 2 mL der TCM in jede Vertiefung der ursprünglichen rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment-beschichteten Platten und lassen für 30 min bei Raumtemperatur, unspezifischen Bindung zu blockieren.
   3. Retrovirus-haltigen überstand von transfizierten Zellen der Plat-E in 15 cm Gewebekultur Gerichte und ersetzen mit 18 mL komplette TCM zu ernten.
      Vorsicht Arbeiten Sie schnell, um zu vermeiden, Trocknen von Plat-E Zellen.
      Hinweis: Erfolg der Transfektion kann in diesem Stadium durch Fluoreszenz-Mikroskopie überprüft werden, ob eine fluoreszierende Marker-gen wie mCherry (Abbildung 1) zu nutzen.
   4. Filtern des Retrovirus-haltigen Überstands durch 0,45 μm-Filter, Zelle Ablagerungen zu entfernen. TCM von rekombinanten menschlichen Fibronektin Fragment beschichtet 6-Well Platten zu entfernen und 2,5 mL gefilterte Retrovirus-haltigen überstand oder in jede Vertiefung (Nutzung komplett TCM zur mock Transfektion). Beschriften Sie jedes gut, die Zugabe von Retroviren oder mock Medien.
   5. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1200 X g für 30 min bei Raumtemperatur.
   6. Während Platten drehen, aktivierte T-Zellen zu sammeln und zählen mit einem Hemocytometer.
      1. Transduktion erfolgt mit 5 x 10⁶ aktiviert splenocyten in insgesamt 5 mL/gut. Pellet-die erforderliche Anzahl von splenocyten für Mock/Transduktion in getrennten Rohren durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 Minuten.
      2. Wieder aussetzen Sie splenocyten bei einer Dichte von 5 x 10⁶ Zellen pro 2,5 mL des gefilterten Retrovirus-haltigen überstand aus Schritt 2.6.4 oder TCM als Negativkontrolle. Fügen Sie rekombinanten menschlichen Il-2 (hIL-2) und rekombinanten Maus IL-7 (mIL-7), eine Endkonzentration von 200 IU/mL und 4 ng/mL bzw..
   7. Sammeln Sie 6-Well Platten aus der Zentrifuge nach Abschluss von Schritt 2.6.5 zu und fügen Sie 2,5 mL/Brunnen neu abgehängte splenocyten in entsprechenden Vertiefungen zu machen ein Finales Volumen von 5 mL/gut und eine Endkonzentration von 100 U/mL hIL-2 und 2 ng/mL mIL-7.
   8. Zentrifugieren Sie die Platten bei 1200 X g für 90 min bei Raumtemperatur. Inkubieren Sie nach Zentrifugation die Platten bei 37 ° C, 5 % CO₂ über Nacht.
7. 5. Tag: Runde 2 der Transduktion
   1. Das rekombinante menschliche Fibronektin-Fragment von den Platten zu sammeln, wie diese wiederverwendet werden kann. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.2 - 2.6.5.
   2. Während Platten drehen, sammeln Sie Zellen von der 1^St Runde Transduktion mit einer Pasteurpipette. Spülen Sie jedes gut mit 2 mL PBS, Wirbeln Sie und sammeln Sie alle verbleibenden Zellen in jede Vertiefung.
      Hinweis: Pipette rauf und runter um sedimentierten Zellen wieder auszusetzen. Sammeln Sie jede Kontrolle/Transduktion Gruppe in getrennten Rohren.
   3. Zentrifuge Rohre bei 500 X g für 5 min. wieder auszusetzen Zellen in 2,5 mL pro Bohrloch der Transduktion mit 200 IU/mL IL-2 und 4 ng/mL IL-7. Wiederholen Sie die Schritte 2.6.7 - 2.6.8.
   4. Entfernen Sie die Zellen aus der Zentrifuge und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 4 Std. sammeln ausgestrahlt Zellen wie in den Schritten 2.7.2-2.7.3.
   5. Zählen der Zellen, bei 500 X g für 5 min zentrifugieren und wieder auszusetzen in der kompletten TCM bei einer Dichte von 1 x 10⁶ Zellen/mL mit 100 U/mL hIL-2 und 2ng/mL mIL-7. Übertragen auf eine entsprechend dimensionierte Kultur Kolben und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO₂.
   6. Hinzufügen von frischen TCM-Medien enthält 100U/mL hIL-2 und 2ng/mL mIL-7 alle 2 Tage, Aufrechterhaltung einer Zelldichte von 1 x 10⁶ Zellen/mL.
      Hinweis: Geerntete splenocyten enthalten eine Vielzahl von Zelltypen. Unter diesen Kulturbedingungen nicht T-Zellen Absterben im Laufe von 2-3 Tagen. Nach ~ 4 Tage in der Zellkultur, die Anzahl der T-Zelle ist in der Regel entspricht die Gesamtzahl der geernteten splenocyten am Tag 0.

3. Messung der Transduktion Effizienz

1. Am 4. Tag Post Transduktion sammeln Sie eine Probe des ausgestrahlt oder nicht ausgestrahlt T-Zellen (ca. 3 x 10⁵ Zellen). Die Zellsuspension bei 500 X g für 5 min zentrifugieren, überstand verwerfen, gebeizte Zellen einmal mit PBS waschen und wieder Zentrifugieren.
2. Den überstand verwerfen und 100 μl PBS mit einem geeigneten Amin Reaktivfarbstoffen(z. B.lebenden/Toten Fleck, 1: 100 Verdünnung) pro Bohrloch hinzufügen. 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
3. Zweimal mit PBS waschen und Zentrifugieren bei 500 X g für 5 min. überstand verwerfen und inkubieren Sie mit 50 μL der FACS-Puffer mit Anti-Maus-CD16/CD32 Antikörper für Fc-Rezeptor blockieren (1: 100 Verdünnung). 10 min bei 4 ° c inkubieren
4. Direkt hinzugefügt werden 50 μL des Antikörpers Färbung master-Mix mit Anti-Maus CD4-BV786 und CD8-BV711 Antikörper (Endkonzentration von 1 μl/Well in FACS-Puffer). 30 min bei 4 ° C im Dunkeln inkubieren. Wiederholen Sie die Waschschritt 3.3. Zellen in 1 % PFA Puffer wieder auszusetzen und halten die im Dunkeln bei 4 ° C bis zur Analyse von Durchflusszytometrie.
5. Analysieren Sie Zellen mit gleichwertigen geeignet Cytometer mit BV711, BV785 und mCherry Fluoreszenz als Marker für CD4 und CD8 Teilmenge und Auto Ausdruck bzw. gating wie in (Abbildung 2).

4. in-vitro- Validierung von Auto T-Zell Aktivität

1. Samen Phänomen gezielt CD19⁺ Tumorzellen mit oder ohne Luciferase Ausdruck bei einer Dichte von 1 x 10⁴ Zellen in 100 μl TCM/Brunnen in einer 96-Well U-Boden Gewebekultur Platte.
2. Fügen Sie 1 x 10⁴ CD19 Auto T Zellen/Brunnen in einem Volumen von 100 μl/Well, ein Effektor Ziel (E:T)-Verhältnis von 1:1 zu erreichen.
   Hinweis: E:T Kennzahlen festgelegt werden für jedes Auto zu konstruieren und gezielt Zelllinie.
3. Allein Verwendung T-Zellen und Tumorzellen allein als Negativkontrollen und T-Zellen angeregt durch Phorbol-Myristate-Acetat (PMA) (50 ng/mL) und Ionomycin (1 μg/mL) als Positivkontrolle für Interferon Gamma (IFNγ) Version. Kokultur Zellen bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 16-24 h.
4. Nach kokultur die Platten 500 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand für weitere IFNγ und IL - 12 p 70 ELISA Analysen zu sammeln.
   Hinweis: Dies kann bei-80 ° c gelagert werden
5. Wieder auszusetzen Sie Zelle Pellets in 100 μl PBS mit Luciferin (Endkonzentration von 1,5 mg/mL). Inkubieren Sie die Platten für 10 min bei 37 ° c Messen Sie dann die Lumineszenz aus jedem Brunnen mit einem geeigneten Luminometer.
   Hinweis: Belichtungszeiten müssen für Zell-Linien und Dichte optimiert werden. Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 3agezeigt. Ex-Vivo Zytotoxizität von Auto-T-Zellen kann auf ausdrücklichen Luciferin von Kokulturen mit Zelllinien mit dem Ziel Antigen Ausdruck geändert werden. Wie Auto-T-Zellen Zielzellen töten, Luciferin freigesetzt wird, daher ist ein Rückgang der Luminometry Signal korreliert mit Zelle zu töten. Non-ausgestrahlt Zellen können oft auf Ziel Zellviabilität, besonders über langen Inkubationszeiten auswirken. Messen Sie die Konzentration von murinen IFNγ und IL - 12p 70 im überstand entsprechend des Herstellers ELISA Protokollen. Repräsentative Ergebnisse erscheinen (Abb. 3 b und 3 c). Ex-Vivo -Aktivierung des Auto-T-Zellen durch kokultur mit Zelllinien mit dem Ausdruck ihrer Ziel-Antigen kann durch die Analyse überstand Inhalte mittels ELISA untersucht werden. Das Verhältnis von Auto-T-Zellen auf Zielzellen und Dauer der kokultur müssen für jedes Auto-Konstrukt, Ziel-Zell-Linie und Analyten optimiert werden. PMA und Ionomycin Behandlung kann als Positivkontrolle verwendet werden, um Qualität der T-Zellen und ihre Fähigkeit zur Reaktion zu bestätigen.

5. Anti-Krebs-Aktivität bei Mäusen zu beurteilen.

1. Protokoll Nr. 1
   1. Durchführen Sie 100 mg/kg intravenös (IV) Lieferung von Cyclophosphamid in 6 bis 8 Wochen BALB/c Mäuse. Dies ermöglicht Tumor Engraftment ohne signifikante Lymphodepletion¹⁷ (Abbildung 4).
      Hinweis: A20 herstellen kann Lymphom mit einer suboptimalen Take Rate mehr als 2 Monate dauern. Dies kann durch den Einsatz von Cyclophosphamid 1 Tag vor der Lieferung der Lymphom-Zellen verbessert werden. Um Lymphoreplete Mäuse zu studieren, haben wir eine Dosis von Cyclophosphamid, die Effizienz des Lymphoms erhöhen könnte, ohne dass Lymphodepletion identifiziert.
   2. Injizieren Sie am nächsten Tag 100 µL 5 x 10⁵ Phänomen A20 B-Zell Lymphom-Zellen geändert, um Luciferase und grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Ausdrücken in Mäusen durch intravenöse (IV) Injektion.
   3. Ermöglichen die Mäuse zu systemischen Lymphomen für ~ 17 Tage.
   4. Bestätigen Sie die Anwesenheit von systemischen Lymphomen durch intraperitoneale (IP) Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System.
      1. Verwenden Sie Separatoren Signal Spillover in angrenzenden Mäuse zu vermeiden. Setzen Sie Mäuse für 1 min auf der Bauchseite mit einer Konstanten Größe Region von Interesse.
      2. Relative light Units (RLU) als Photonen pro Sekunde (p/s) anzeigen. Einstellungen müssen für jeden Tumor Modell optimiert werden; Verwenden Sie eine Ausstellung, die Früherkennung von Tumoren abholen kann, aber führt nicht zur Sättigung, wie Tumoren Endpunkte erreichen.
      3. Rekord insgesamt RLU für jede Maus mit einer Konstanten Größe Region von Interesse. (Abb. 5a und b).
   5. Eine Einzeldosis von 1 x 10⁶ Auto-T-Zellen durch IV Injektion in Lymphoreplete Mäuse mit etabliert-Lymphom zu injizieren.
      Hinweis: (wichtig) Dosierung von Ebenen muss für jede eingeführt werden, Auto zu konstruieren, mit einer Dosis Eskalation Zeitplan, damit jede möglichen Toxizitäten aus Auto-T-Zellen sind gekennzeichnet und angesprochen werden können. Obwohl Anti-Maus-CD19-Auto-T-Zellen nicht Toxizitäten angezeigt werden, können Auto-T-Zellen zu unerwarteten Toxizitäten führen. Wo mehrere Auto-Konstrukte und Transduktion Effizienz nicht identisch sind, sollte die Gesamtzahl der T-Zellen verabreicht durch die Zugabe von T-Zellen nicht ausgestrahlt in Zelle Vorbereitungen gleich gehalten werden.
   6. Überwachen Sie Krankheitsprogression wöchentlich durch IP-Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System (Abbildung 5 c).
   7. Aufmerksam verfolgen Sie Mäuse auf Anzeichen von Toxizität und einschläfern Sie keine Mäuse, die frühe Anzeichen der hinteren Extremität Lähmung (HLP) oder pathologischen tumorlast zeigen, bevor alle leiden entstehen kann.
      Hinweis: Toxizitäten von A20 Lymphom zählen Hind Extremität Lähmung durch Tumorinvasion von der Hirnhaut. Überprüfen Sie regelmäßig Frühzeichen veränderten Gangbild. Ebenso können große IP-Tumoren entstehen, die zu Beschwerden durch verändertes Verhalten gezeigt führen kann.
   8. Überleben der Mäuse für 60-100 Tage (Abb. 5D) zu überwachen. Durchführen Sie Euthanasie durch einen Anhang-1-Methode nach Abschluss des Experiments.
2. Protokoll Nr. 2
   1. Liefern Sie Cyclophosphamid 200 mg/kg 6 bis 8 - Wochen alten BALB/c Mäuse durch Rute Vene Injektion in 100 μl PBS per Mausklick.
   2. Am folgenden Tag injizieren von 5 x 10⁵ Phänomen A20 B-Zell-lymphomzellen Ausdruck Luciferase und GFP 100 μl PBS über Heck Vene injizieren.
   3. Ermöglichen die Mäuse zu systemischen Lymphomen für ~ 7-14 Tage
   4. Systemischen Lymphomen durch IP-Injektion von 100 μL von 30 mg/mL Luciferin und Bildgebung mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System zu bestätigen.
   5. Durchführen Sie 5 Gy-Ganzkörper-Bestrahlung (TBI) bei 0,02 Gy/min für Lymphodepletion.
      Hinweis: Patienten, die Auto T-Zell-Behandlungen unterziehen, eine Reihe von Therapien, um Lymphodepletion zu erreichen, bevor die Verwaltung der Auto-T-Zellen die erhöht das Engraftment des adoptively Auto T-Zellen übertragen. Dies kann bei Mäusen mit Ganzkörper-Bestrahlung (TBI) (Abbildung 6) repliziert werden.
   6. Am nächsten Tag injizieren Sie 1 x 10⁶ Auto-T-Zellen in 100 μl PBS über Heck Vene Injektion in Mäusen mit gegründet Tumoren.
   7. Sammeln Sie Blut Proben über Heck Vene blutet nach 7 Tagen.
   8. Jede Blutprobe fügen Sie rote Zelle Lysis Puffer hinzu, dann Durchflusszytometrie bereiten Sie vor, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Analysieren Sie Auto T Zelle Persistenz in der Zirkulation durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2).
      Hinweis: Zugabe von zählen Perlen unmittelbar vor zytometrie ermöglicht die Bestimmung der Anzahl der Auto-T-Zellen pro Milliliter Blut.
   9. Überwachen Sie Krankheit Fortschritt, wie 5.1.5 - 5.1.8 (Abbildung 7) beschrieben.

Für hohe Effizienz Transduktion von T-Zellen ist es notwendig, frische retroviralen Partikel zu erhalten. Transfektion von Plat-E-Zell-Linie mit pCL-Eco Produzent Plasmid und pMP71 Retrovirus Plasmid ergibt sich die Sekretion von retroviralen Partikel in die Zelle überstand. Wenn eine fluoreszierende Marker-gen, wie z. B. mCherry, in den Retrovirus codiert ist, kann erfolgreich Transfektion durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 1) bestätigt werden. Virus-haltigen überstand von transfizierten Zellen Plat-E wird verwendet, um die T-Zellen transduzieren von Spin-Perfektion auf Fibronektin Fragment-beschichteten Platten über 2 Runden. Die Effizienz der Transduktion kann 4 Tage post Transduktion über Durchflusszytometrie bestimmt. Erfolgreich ausgestrahlt Zellen zum Ausdruck bringen des Marker-Gens codiert in den Retrovirus (Abbildung 2). Transduktion Wirkungsgrade reichen von ~ 50-90 % Wirkungsgrad mit Rezeptoren der ersten Generation, ~ 10-40 % mit dem Auto in der Nähe der retroviralen Verpackungsleistung konstruiert. Während Marker-gen-Expression erfolgreich retrovirale Transduktion zeigt, ist es ausschlaggebend für die Funktionalität des CAR-T-Zellen bei der Auseinandersetzung mit Zellen das ausdrückliche Ziel-Antigen auf ihrer Oberfläche zu zeigen. Ziel Zelllinien geändert, um ausdrückliche Luciferase können in Luciferase-Assays verwendet werden, um den Grad der Zelle-Kill durch Auto-T-Zellen direkt (Abbildung 3A) zu testen. Die Freisetzung von Effektor Zytokine aus Auto-T-Zellen auf kokultur mit Zielzellen, bestimmt durch ELISA, kann auch als indirekte Messung der CAR T Zelle Zytotoxizität (Abb. 3 b und 3 C) verwendet werden.

CAR-T-Zellen produziert, die in diesem Protokoll können bei Lymphoreplete Mäusen ausgewertet werden, durch die Schaffung von systemischen A20-Lymphom mit einer Dosis von 100 mg/kg von Cyclophosphamid (eingespritzt intravenös), 1 Tag vor IV Injektion von 5 x 105 A20 Zellen (Abbildung 4). IP-Injektion mit Luciferin und Bilderfassung mit einer in-Vivo -Biolumineszenz-Imager kann verwendet werden, tumorlast mit einer Konstanten ROI und Belichtung Zeit im gesamten (Abbildung 5A-C) zu überwachen. CAR-T-Zellen geändert, um ausdrückliche IL-12 sind in der Lage, die Beseitigung der systemischen Lymphomen mit Lymphodepleting Vorklimatisierung geben krankheitsfreien Überlebens in etwa 25 % der Mäuse (Abbildung 5). Lymphodepleting Vorkonditionierung, verbessert erreicht durch 5 Gy TBI 1 Tag vor die intravenöse Verabreichung von Auto-T-Zellen deutlich Engraftment (Abbildung 6). In diesem Modell sind erste Generation-Auto T-Zellen in der Lage, der Beseitigung der systemischen A20-Lymphom, in der Regel induzierende krankheitsfreien Überlebens in 100 % der Mäuse (Abbildung 7).

Abbildung 1: Bestätigung der erfolgreichen Transfektion von Zellen Plat E. Plat-E Zellen transfiziert mit retroviralen Auto konstruieren und pMP71 und Pcl-Eco Verpackung Vector Plasmid DNA. Erfolgreiche Transfektion wird durch die Expression des Gens mCherry fluoreszierenden Marker angezeigt. (A) Hellfeld-Mikroskopie, (B) Fluoreszenz-Mikroskopie und (C) fusionierten Bilder angezeigt werden. Vergrößerung = 50 X. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Bestimmung der Transduktion Effizienz durch Durchflusszytometrie. Durchflusszytometrie wird verwendet, um festzustellen, die Transduktion Effizienz der T Mauszellen am 4. Tag Post Transduktion, mit Zombie UV lebenden/Toten, mCherry, BV711 und BV785 für den Nachweis von live, Auto bauen, CD4 und CD8-Zellen, beziehungsweise. Repräsentative Ergebnisse der A) nicht ausgestrahlt, (B) mCherry.αmCD19.mCD3z und (C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 sind mit Anspritzung 1 gezeigt) Unterhemden 2) Leben Zellen 3) CD4 und CD8 (4) und (5) Bewertung der mCherry positive Zellen Auto zum Ausdruck zu bringen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Validierung von Auto T-Zell-Aktivität. ΑmCD19-Auto-T-Zellen wurden mit A20-Lymphom-Zellen geändert, um ausdrückliche Luciferase Co kultiviert (1 x 104: 1 x 10-4) für 16 h in ein U-Boden-96-Well-Platte. Nach kokultur Zellen wurden oelletiert und überstand wurde gesammelt. A) Zellen wurden neu in PBS schweben und Luminometry wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zielzellen zu beurteilen. Überstand von kokultur wurde auf das Vorhandensein von IFNγ (B) und IL-12 (C) bewertet. Das Verhältnis von Auto-T-Zellen auf Zielzellen und Dauer der kokultur optimiert werden müssen für jedes Auto zu konstruieren und gezielt Zelllinie. PMA und Ionomycin Behandlung kann als Positivkontrolle verwendet werden, um Qualität der T-Zellen und ihre Fähigkeit zu reagieren zu bestätigen. Fehlerbalken zeigen SD statistische Analyse mit Hilfe einfache ANOVA durchgeführt wurde. p < 0,001). Diese Zahl wurde von17geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4. Zur Gründung A20 Lymphom ohne Lymphodepletion. Cyclophosphamid kann Effizienzsteigerung von Lymphom Induktion ohne Lymphodepletion zu verursachen. A) Blutbild von 6-8-Woche-alten BALB/c Mäusen nach IV Lieferung von 100 mg/kg von Cyclophosphamid. Fehlerbalken zeigen SD B) Lymphom Belastung von 6-8-Woche-alten BALB/c Mäusen nach IV Lieferung von 100 mg/kg von Cyclophosphamid oder Kochsalzlösung am Tag-1 und IV Lieferung von 5 x 105 A20 Zellen am Tag 0 mit einem Luminometer gemessen. ( C) Überleben der Mäuse in B). Fehlerbalken zeigen SD statistische Analyse mit 2-Way ANOVA durchgeführt wurde. ** p < 0,01 *** p < 0,001). Diese Zahl wurde von Kueberuwa Et Al. modifiziert 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5. Überwachung von Lymphom Belastung und überleben. Mäuse mit A20 Lymphom mit dem Ausdruck Luciferase erhalten 100 µL intraperitoneale (IP) Injektionen von 30 mg/mL Luciferin und wurden mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System abgebildet. (A) Mäuse waren ausgesetzt für 1 min auf der Bauchseite und sofort umgedreht auf Bild dorsalen Tumormassen auf beiden Seiten der Organe (B)abholen. C) repräsentative Ergebnisse der Lymphom-Belastung von BALB/c Mäusen erhalten unterschiedliche αmCD19 Auto T-Zellen ohne Lymphodepletion. Fehlerbalken zeigen SEM D) Überlebensrate der gleichen Mäuse. Diese Zahl wurde von Kueberuwa Et Al. modifiziert 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6. Auswirkungen der Lymphodepletion. (A) Blutbild von 6-8-Woche-alten BALB/c Mäusen nach Erhalt 5 Gy TBI mit einer Dosisrate von 0,02 Gy/min; Fehlerbalken zeigen SD statistische Analyse von zwei-Wege-ANOVA. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. B) Überwachung von CD4+ und CD8+ Auto T-Zellen im peripheren Blut von Mäusen durch Durchflusszytometrie für die mCherry Marker-Gen 7 Tage Post Verwaltung. Fehlerbalken zeigen SD Diese Zahl wurde von Kueberuwa Et Al. modifiziert 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7. Auto-T-Zell-Aktivität mit Vorkonditionierung Lymphodepleting. Typische Ergebnisse, die die Wirkung von 5 Gy TBI am Tag vor dem Auto T-Zell-Verwaltung. (A) Bildgebung und (B) grafische Darstellungen der Bildgebung von Mäusen nach 100 µL intraperitoneal (IP) Injektionen von 30 mg/mL Luciferin mit einer Biolumineszenz in Vivo imaging-System. Fehlerbalken zeigen SEM. C) Überleben der gleichen Mäuse. Diese Zahl wurde modifizierte FromKueberuwa Et al. 17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

David Gilham arbeitet für Celyad, die bei der Herstellung von Auto-T-Zellen beteiligt ist. Der Rest der Autoren haben nichts preisgeben.