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Methodenartikel

Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von ROS-Produktion In Makrophagen als Reaktion auf FcγR Vernetzung

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DOI:

10.3791/59167

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7. März 2019

 , 
1Division of Immunity and Pathogenesis, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Diese Studie zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoff Spezies (ROS) Produktion durch Aktivierung der FcγR zu erkennen. Diese Methode kann verwendet werden, Änderungen in der antimikrobiellen und Redox signaling Funktion der Phagozyten in Reaktion auf Immunkomplexe, opsonized Mikroorganismen oder direkte FcγR Vernetzung zu beurteilen.

Zusammenfassung

Die oxidative oder respiratorische Burst wird verwendet, um den schnellen Verbrauch von Sauerstoff und Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) beschreiben durch Phagozyten in Reaktion auf verschiedene Reize immun. ROS erzeugt während der Immunaktivierung übt starke antimikrobielle Aktivität vor allem durch die Fähigkeit von ROS, DNA und Proteine, beschädigen Tod von Mikroorganismen verursacht. ROS-Produktion mit Leichtigkeit und reproduzierbar messen ist notwendig, um den Beitrag der verschiedenen Wege und Moleküle zu diesem Mechanismus der Host Verteidigung zu bewerten. In diesem Papier wir zeigen die Verwendung von fluoreszierenden Sonden und flow Cytometry um ROS-Produktion zu erkennen. Obwohl weit verbreitet, wird Fluoreszenz Messung von ROS notorisch problematisch, vor allem im Hinblick auf die Messung von ROS durch spezifische und nicht Mitogene Reize induziert. Wir präsentieren Ihnen eine detaillierte Methode um ROS erzeugt durch spezifische FcγR Stimulation beginnend mit Makrophagen-Generierung, Grundierung, Färbung, FcγR Vernetzung und endend mit durchflusszytometrischen Analyse zu erkennen.

Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind reaktive Moleküle oder freie Radikale, die Nebenprodukte der aeroben Atmung (rezensiert in 1). Dazu gehören die Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid, Wasserstoffperoxid, Hydroxyl-radikal und Hydroxyl-Ionen, unter anderem. Unter normalen physiologischen Bedingungen ROS entstehen vor allem durch die Mitochondrien und Nicotinamid Adenin Dinucleotide Phosphat (NADPH) Oxidasen und werden schnell durch verschiedene Enzyme und Proteine wie Superoxid-Dismutase und Glutathion entgiftet. Eine übertriebene Produktion von ROS oder ein Defekt in der Fähigkeit, ROS entfernen führt zu oxidativem Stress, wobei reaktive Sauerstoffspezies den Schaden der Proteine, Lipide und DNA zu zellulären Stresses oder Tod und pathologischen Krankheitszuständen führen zu fördern. Allerdings ist es derzeit geschätzt, dass ROS kann auch als Signalmoleküle (Redox signaling) fungieren, und ROS-vermittelten Modifikation verschiedener Moleküle und Weg Zwischenprodukte zellulären Stoffwechsel, Vermehrung, überleben, entzündliche beeinflussen Signalisierung und Alterung2. In phagocytic Zellen spielt ROS eine wesentliche Rolle bei der Bereitstellung von antimikrobielle Aktivität während der sogenannten "respiratorischen Burst"1,3,4,5,6. Während die Reaktion der Phagozyten auf äußere Reize translozieren Komponenten von der NADPH-Oxidase Komplex (p40Phox, p47Phox, p67Phox) aus dem Zytosol der phagosomal Membran mit gp91phox und p22phox Untereinheiten, und zusammen mit den Maßnahmen der Rac1/2 bilden eine voll funktionsfähige NADPH Oxidase Enzymkomplex. Die montierten NADPH-Oxidase nutzt dann NADPH um Sauerstoff zu Superoxid innerhalb der phagosomal Vakuole zu reduzieren. Superoxid-Anionen können direkt schädigen oder in Wasserstoffperoxid dismutated werden. Superoxid und Wasserstoffperoxid reagieren mit anderen Molekülen, hochreaktive Hydroxyl-Radikale zu generieren. Schaden wird durch Reaktion von diesen ROS mit Eisen-Schwefel-Clustern auf Proteine oder durch Basis Oxidation von DNA, die letztlich zu beschränkten mikrobiellen Stoffwechsel oder Tod der Mikrobe5vermittelt. Die Bedeutung der NADPH-Oxidase Enzymkomplex und ROS produziert während der respiratorischen Burst zeigt klinisch bei Patienten mit chronisch granulomatöse Erkrankung (CGD)7,8,9, 10. Personen mit CGD besitzen Mutationen im gp91phox, was zu einem Mangel der ROS-Produktion und Anfälligkeit für rezidivierende Infektionen mit Bakterien und Pilzen, die nicht in der Regel ein Anliegen mit immunkompetenten Individuen sind. Deshalb ob oxidativer Stress, Redox signaling oder Host Verteidigung, die Möglichkeit, Messen ROS-Produktion in Echtzeit ein nützliches Unterfangen.

Mehrere Proben wurden an die Maßnahme ROS Produktion oder die Ergebnisse von oxidativem Stress11,12,13genutzt. Unter diesen ist eine der am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Sonde 2', 7' Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (RLKV2-DA)14. Dieses Molekül ist farblos und lipophil. Diffusion von RLKV2-DA in der Zellmembran ermöglicht es, von intrazellulären Esterasen, einwirken lassen, die es in RLKV2 deacetylates, wodurch es Zelle undurchlässig. Die Aktionen von mehreren Arten von ROS (Wasserstoffperoxid, Peroxynitrit, Hydroxyl-radikale, Stickstoffmonoxid und Peroxy radikale) auf RLKV2 oxidieren es in DCF, fluoreszierende (gemeldeten Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) und kann eine Strömung erfasst werden CYTOMETER ausgestattet mit einem standard-Filter für Fluorescein (FL1 Kanal) festgelegt. Superoxid reagiert nicht stark mit RLKV2 aber mit einer anderen Sonde Dihydroethidium (DHE) liefern die fluoreszierenden Produkt 2-Hydroxyethidium (sowie andere fluoreszierende Superoxid-unabhängige Oxidationsprodukte)15reagieren kann. Die fluoreszierende Produkte der DHE Oxidation können erkannt werden, mit Hilfe einer Anregung Wellenlänge von 518 nm und einer Emissionswellenlänge von 605 nm (FL2 Kanal). Obwohl relativ einfach zu bedienen, erfordert Nutzung diese Sonden für die Erkennung von ROS wissen über ihre Grenzen und sorgfältige Einarbeitung der Färbung Verfahren und Kontrollen in den spezifischen Assay wird durchgeführt, um gültige experimentelle Ergebnisse und Schlussfolgerungen. Das folgende Protokoll veranschaulicht die Verwendung eines handelsüblichen Kits mit diesen 2 Sonden durch Durchflusszytometrie ROS messen soll. Wir färben grundierte Knochenmark stammenden Makrophagen mit diesen Sonden und ROS-Produktion durch FcγR Vernetzung zu induzieren. Wir präsentieren repräsentative Daten unter Verwendung dieses Protokolls und betonen entsprechende Vorsichtsmaßnahmen, die für erfolgreiche Experimente durchgeführt werden müssen.

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Protokoll

Das Protokoll für den Umgang mit Tieren wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss (IACUC) der University of Central Florida genehmigt.

1. Generation des Knochenmarks abgeleiteten Makrophagen (BMDMs)

  1. Nährmedien Vorbereitung
    1. Bereiten Sie D10F base Medien: zu Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert fetalen bovine Serum (FBS), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES) und 0,05 mM β-Mercaptoethanol.
      Hinweis: Obwohl es am besten, frischen D10F Medien nutzen, können D10F base Medien bis zu zwei Wochen im Voraus vorbereitet werden für mehrere Versuche innerhalb einer Woche verwendet werden. Für eine Maus ist ca. 175 mL D10F base Medien benötigten (25 mL, die Knochen zu spülen) und 150 mL zu Makrophagen Differenzierung Medien
    2. LADMAC Wachstumsmedien vorbereiten: zum Adler Minimum wesentliche Medium (EMEM), fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert FBS und 2 mM L-Glutamin. Die Medien-frisch zubereiten, am Tag Sie beabsichtigen, Ihre Kulturen zu starten.
      Hinweis: Ein Liter LADMAC Wachstumsmedien rund (19) 50 mL Aliquote LADMAC konditioniert Medien führt.
    3. Bereiten Sie komplette DMEM Medien: DMEM, hinzufügen 10 % Hitze inaktiviert FBS und 1 x Antibiotikum Antimykotikums. Die Medien-frisch zubereiten, am Tag wird BMDMs geerntet werden.
      Hinweis: Für eine Maus, etwa 100 mL DMEM komplette Medien benötigt werden. Dazu gehören Medien zum Grundieren der Zellen verwendet.
  2. Vorbereitung des LADMAC konditionierten Mediums
    1. Wachsen Sie LADMAC Zellen, Konfluenz in einer 10 cm Petrischale mit 10 mL LADMAC Wachstumsmedien (definiert in 1.1.2). Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2.
    2. Lösen Sie bei Konfluenz die Zellen durch den Verzicht auf Medien mit Nachdruck über Zellen. Durchgang-Zellen durch Zugabe von 1 mL der freistehende Zellen in T-175 Fläschchen mit 100 mL LADMAC Wachstumsmedium. Inkubieren Sie Zellen bis komplett konfluierende bei 37 ° C, 5 % CO2 (ca. eine Woche). Auf diese Weise kann ein 10 cm Teller zehn T-175 Flaschen oder etwa 1 L des konditionierten Medien ergeben.
    3. Sobald die Zellen fertig sind, sammeln Sie die konditionierten Medien und Zentrifuge bei 350 X g für 5 min zu unerwünschte Zellen Pellets. Filtern Sie die gesammelten Überstände durch eine 0,2 mm Filter und speichern Sie 50 mL Aliquote bei-80 ° C. Aliquote LADMAC konditioniert Medien können monatelang mit minimalem Verlust an Aktivität bei-80 ° C gehalten werden.
      Hinweis: Wenn große Experimente zu erwarten sind, bereiten Sie große Chargen von LADMAC bedingt Medien zur gleichen Zeit um Konsistenz zu gewährleisten. Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie Aliquote abgeleitet aus der gleichen Charge oder viele LADMAC konditioniert Medien für jedes Experiment.
  3. Vorbereitung des Knochenmarks abgeleiteten Makrophagen
    1. Am Tag des Experiments bereiten Sie frische Makrophagen Differenzierung Medien durch Zugabe von 25 % des LADMAC bedingt Medien in vorbereitete D10F Medien (1 Teil LADMAC konditioniert in 3 Teile D10F). Bereiten Sie diese Medien nicht im Voraus! Bereiten Sie nur so viel Medien Bedarf für die BMDM-Kultur.
    2. Tag1: Maus Knochenmarkzellen nach den zuvor beschriebenen Protokoll16 mit einer Änderung an das Knochenmark aus Oberschenkelknochen und Gebeinen D10F base Medien spülen zu isolieren. Verwenden Sie 2,5 mL D10F Medien um zu beiden Enden der Knochen (4) zu spülen. Bündig Knochenmarkzellen direkt in ein Sieb vor nassen 40 mm Zelle platziert eine 50 mL-Tube. Die restlichen Medien (ca. 5 mL) können verwendet werden, um die Zelle Sieb ausspülen.
    3. Zentrifugieren gesammelten Knochenmarkzellen bei 350 X g für 5 min. verwerfen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen in insgesamt 30 mL von Makrophagen Differenzierung Medien (per Mausklick).
    4. Bereiten Sie vor und beschriften Sie (6) steril 10 cm Petrischalen. Platte 5 mL Makrophagen Differenzierung Medien in jedem in der Petrischale. Aliquoten 5 mL resuspendierte Knochenmarkzellen in Makrophagen Differenzierung Medien in jede Petrischale für ein Gesamtvolumen von 10 mL pro Schale. 5 Tage bei 37 ° C, 5 % inkubieren CO2.
    5. Tag 5: aspirieren Sie Medien aus den Zellen. Einmal mit 1-2 mL PBS waschen Sie und 10 mL frisch zubereitete Makrophagen Differenzierung Medien. Inkubieren Sie 3 Tage lang ein zusätzliches.
    6. Tag 8: Fahren Sie bis zur Ernte BMDMs, wie unten beschrieben.

(2) Ernte, Aussaat und Grundierung der BMDMs

  1. Nach 7 Tagen wächst die BMDMs in den Makrophagen Differenzierung Medien entfernen des Überstands. Waschen Sie anhaftende Makrophagen einmal mit 1-2 mL PBS. Aspirieren Sie die PBS.
  2. 1 mL von 0,25 % zu verzichten Trypsin-EDTA in jeder Makrophagen Platte und lassen Sie sie im Inkubator 37 ° C für ca. 5-10 min mit häufigen klopfen um die Zellen zu lösen. Trypsiniert Makrophagen durch nach oben und unten mit einer P1000 Pipette Pipettieren distanzieren und Makrophagen in 50 mL Röhrchen mit 10-15 mL komplette DMEM Medien zu sammeln. Waschen Sie die Platte mit zusätzlichen 2 mL komplette DMEM Medien, alle übrigen Makrophagen zu ernten.
    Vorsicht: Lassen Sie nicht Makrophagen in Trypsin für mehr als 10 Minuten.
  3. Zentrifugieren Sie den 50 mL-Röhrchen bei 350 X g für 5 min. verwerfen des Überstands. Sanft das Pellet distanzieren und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL komplette DMEM Medien. Graf Makrophagen mit einer Hemocytometer in der Gegenwart eine Lebensfähigkeit färben wie Trypan blau wie folgt:
    1. Mischen Sie zum Beispiel 90 µL Trypan blau mit 10 µL Zellen für eine 01:10 Verdünnung.
    2. Dieser Mischung 10 µL in einem Hemocytometer laden und zählen des zentralen Platzes (5 x 5 Raster). Die gesamte Zellzahl = Anzahl X 104 x Verdünnung Faktor (10) X Volumen (10 mL).
  4. Passen Sie die Zellsuspension um 1 Million/mL in komplette DMEM Medien und Platte 4 mL Diese Zellsuspension in jedes Gericht 6 cm betragen.
    Hinweis: Ein Minimum von 3 Platten wird pro Experiment benötigt. Eine Platte von Zellen werden links unstimulierte, eine zweite Gruppe von Zellen wird durch die Vernetzung der FcγRs stimuliert werden, und die dritte Platte von Zellen dienen alle der zusätzlichen experimentellen und Ablaufsteuerungen durchflusszytometrischen.
  5. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.
  6. Am Folgetag Aspirieren des Überstands, waschen Zellen einmal mit 1-2 mL PBS. Hinzugeben Sie 4 mL komplette Medien mit 100 ng/mL Maus IFN-γ auf jede Platte. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.
  7. Falls gewünscht, nehmen Sie ein Aliquot der Zellen, um entsprechende Generation von BMDMs durch Durchflusszytometrie zu beurteilen. Verwenden Sie 1 x 106 Zellen pro Test und bereiten Polystyrol FACs-Röhren für die folgenden Bedingungen: Isotype Steuerung, befleckt mit F4/80 (oder alternativ gebeizt mit CD11b).
  8. Vorbereiten der Durchflusszytometrie Fleckenbildung Puffer durch Zugabe von 0,1 % FBS in 1 X PBS. Verwenden Sie nur diese Menge an FBS, um nicht die Auswirkungen der Serum-Hungersnot in späteren Schritten zu negieren.
  9. Aliquoten 1 x 106 Zellen pro Rohr und Zentrifuge bei 750 X g für 5 Minuten.
  10. Waschen Sie einmal durch Dekantieren oder Absaugen überstand und resuspending Zellen in 2 mL Flow Cytometry Puffer. Zentrifuge bei 750 X g für 5 Minuten.
  11. Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in 100 µL der Durchflusszytometrie Fleckenbildung Puffer. Jedes Rohr 1 µL Anti-Maus CD16/32 Fc blockierende Antikörper hinzufügen. Inkubieren Sie für 5 min auf Eis.
  12. Ohne waschen, fügen Sie 2 µL FITC Anti-Maus F4/80 oder 1 µL APC Anti-Maus CD11b Antikörper hinzu "gefärbt" Rohre und eine ähnliche Menge an der entsprechenden Isotype Kontrolle Antikörper "Isotype" Röhren. Auf dem Eis, im Dunkeln, 30 min inkubieren.
  13. Waschen Sie Zellen durch Zugabe von 2 mL PBS direkt auf die Zellen. Zentrifuge bei 750 X g für 5 Minuten.
  14. Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Zellen in 150 µL PBS.
  15. Proben auf einem Durchflusszytometer mit einer Stop-Bedingung von 100 µL oder 10.000 Veranstaltungen auf das Tor von Interesse zu erwerben und zu gewährleisten, dass FSC, SSC, FL1 (FITC Anti-Maus F4/80) oder FL4 (APC Anti-Maus CD11b) Kanäle für die zu analysierenden Parameter ausgewählt sind.
  16. Mit Hilfe der Flow Cytometry Software, öffnen Sie einen Dot-Plot für FSC (auf der x-Achse) Vs SSC (auf die y-Achse) und ein Tor zu ziehen, um die Zellen von Interesse, mit Ausnahme von abgestorbenen Zellen und Schutt (abgestorbene Zellen und Schmutz sind viel kleiner als die wichtigsten Zellenbevölkerung und erscheinen auf der Lowe R links des Grundstückes).
  17. Anspritzung auf die Zellen von Interesse, ein Histogramm-Grundstück mit FL1 öffnen (FITC Anti-Maus F4/80) oder FL4 (APC Anti-Maus CD11b) auf der x-Achse.
  18. Führen Sie das Beispiel "Isotype". Ein Marker-Tor zu erzeugen, so sind, dass die Mehrheit der "Isotype" Probe Ereignisse auf der linken Seite des Tores (< 1 % positiv). Diese Vorlage auf die gefärbten Beispieldatei anwenden.
  19. Führen Sie das Beispiel "gefärbt". Führt zu erfolgreichen Generation von BMDMs > 95 % Ausdruck der FITC Anti-Maus F4/80 oder APC Anti-Maus CD11b (Abbildung 1A), während falsche Kulturbedingungen suboptimale Generation von Makrophagen (Abbildung 1 b) führen können.
    Hinweis: Wenn BMDMs aus mehreren Genotypen zu generieren, beachten Sie den Ausdruck dieser Marker für jede Charge eines BMDM erzeugt, in dem Fall, dass dies möglicherweise Gründe für den Ausschluss einer Stichprobe aus Analyse, wenn ROS Generation als Reaktion auf einen Stimulus bewertet wird.

(3) Reagenz und Material Vorbereitung auf ROS-Messung

  1. Bereiten Sie lyophilisierter oxidativen Stress Erkennung Reagenz in 60 µL des wasserfreien DMF eine Stammlösung 5 mM liefern. Mischen Sie vor Gebrauch vorsichtig.
    Hinweis: In der ROS-ID Kit Anleitung heißt es, dass die Haltbarkeit des wiederhergestellten Reagenzes ca. 1 Woche bei-20 ° C beträgt. Aliquotierung der Reagenz unmittelbar nach Rekonstitution in kleinen Fläschchen lichtdicht seine Oxidation minimiert und maximiert die Haltbarkeit bei-20 ° C.
  2. Bereiten Sie lyophilisierter Superoxid Erkennung Reagenz in 60 µL des wasserfreien DMF eine Stammlösung 5 mM liefern. Mischen Sie vor Gebrauch vorsichtig.
    Achtung: da in der Kit-Anleitung beschrieben behandeln Sie beide Nachweisreagenzen als mögliche Mutagene, umgehen Sie jeweils mit Sorgfalt und entsorgen Sie richtig damit.
  3. Bereiten Sie die ROS-Induktor (Pyocyanin) in 20 µL des wasserfreien DMF um ein 50 mM-Stammlösung zu erzielen.
  4. Bereiten Sie die ROS-Inhibitor (N-Acetyl-L-Cystein) in 123 µL deionisiertes Wasser um eine 0,5 M Lager Konzentration zu erzielen.
  5. Beschriften Sie 5 mL Polystyrol Rundrohre (Flow Cytometry Röhren) mit der experimentelle Kontrollen und Auflagen. (Siehe 4. Assay-Bedingungen und Kontrollen)
  6. Vorbereiten der niedrigen Serum DMEM (kein Phenol-rot) durch Zugabe von 0,1 % FBS zu Phenol Rotfrei-DMEM.
  7. Aliquot der Anti-BSA-Antikörper in kleinen Aliquote (je nach Nutzung) und bei-80 ° c aufbewahren
  8. Vorbereiten von 100 mg/mL BSA in HBSS-Stammlösung (Hanks ausgeglichen Salzlösung) oder PBS. Aliquot in 100 µL Aliquots und Store bei-20 ° C.
  9. Bereiten Sie eine 2 X Lösung der ROS-Sonden (2 x Sonde Lösung): für je 10 mL der niedrigen Serum DMEM, fügen Sie 4 µL des oxidativen Stress-Erkennung Reagenz (grüne Farbe) und 4 µL Superoxid Erkennung Reagenz (orange Farbstoff).
  10. Bereiten Sie 2 x Sonde Lösungen nur mit oxidativem Stress Erkennung Reagenz (2 x Sonde Lösung, nur grün) oder enthalten nur Superoxid Erkennung Reagenz (2 x Sonde Lösung, nur Orange). Bereiten Sie nur die Menge an Reagens für das Experiment benötigt und immer bereiten Sie 2 X Lösung unmittelbar vor Gebrauch zu.
    Hinweis: Um kleinere Mengen von 2 x Angriffsermittlungslösung vorzubereiten, verwenden Sie eine mittlere 01:10 Verdünnung der Grün und Orange Nachweisreagenzen vor Endverdünnung in DMEM. Zum Beispiel um 1 mL eines 2 x Erkennung Lösung vorzubereiten, verdünnen 1 µL jede Sonde in 9 µL DMEM (01:10 Mittelstufe Verdünnung). 4 µL dieser Verdünnung 01:10 Mittelstufe Verdünnung in 1 mL DMEM.

(4) assay Bedingungen und Kontrollen

  1. Umfassen Sie die folgenden experimentellen Steuerelemente für Durchfluss durchflusszytometrischen Entschädigung für jedes Experiment:
    (a) ungefärbten und unstimulierte Zellen.
    (b) Zellen nur mit dem oxidativen Stress-Erkennung-Reagenz (grüne Reagenz) gebeizt und mit ROS-Induktor behandelt.
    (c) Zellen nur mit dem Superoxid-Erkennung-Reagenz (orange Reagenz) gebeizt und mit ROS-Induktor behandelt.
  2. Gehören Sie für jede Maus oder biologische replizieren die folgenden 6 Bedingungen:
    (a) ungefärbten und unstimulierte Zellen
    (b) gefärbten und unstimulierte Zellen
    (c) gefärbten Zellen mit positiver Induktor behandelt
    (d) gefärbten Zellen mit positiver Induktor und ROS-Inhibitor behandelt
    (e) gefärbten Zellen aktiviert durch Vernetzung FcγR
    (f) gefärbten Zellen durch FcγR Vernetzung aktiviert und mit ROS-Inhibitor behandelt
  3. Berechnen Sie der Betrag von 2 x Sonde Lösung basierend auf der Anzahl von Mäusen und Bedingungen (200 µL des 2 x Sonde Lösung wird für jede Bedingung erfordert Färbung verwendet werden).
    Hinweis: Für eine Probe mit 6 Mäusen, werden 5 Bedingungen erfordern Färbung mit den Sonden pro Maus benötigt werden. Damit die Gesamtzahl der Bedingungen bei 30. So ist der Gesamtbetrag der 2 X Sonde Lösung benötigt mindestens 6 mL (30 * 200 µL).

5. Handy Vorbereitung

  1. Nach dem Grundieren der Makrophagen über Nacht, den Überstand abgesaugt. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS.
  2. Serum verhungern die Zellen durch den Austausch von Medien mit dem gleichen Volumen des niedrigen Serum DMEM. Für jede Maus eine Platte behandelt werden mit Anti-BSA IgG1 während Serum am verhungern, während der andere bleibt unbehandelt. Unbehandelte Platten nur niedrige Serum DMEM hinzufügen. Fügen Sie niedrige Serum DMEM mit 2,5 µg/mL murine Anti-BSA IgG1 behandelten Platten.
    Hinweis: Eine unbehandelte Zusatzschild ist für jedes Experiment für die Entschädigung von Ablaufsteuerungen durchflusszytometrischen benötigt.
  3. Inkubieren Sie die Platten für 4 h bei 37 ° C, 5 % CO2.
  4. Nach Serum hungern Ernte der Zellen durch sanfte Kratzen oder mithilfe von 0,2 mM EDTA mit PBS-Puffer. Sammeln sie in beschrifteten 5 mL unten Rundrohre und Zentrifuge auf 750 X g für 5 min. welche Zellen den Überblick behalten wurden mit murine Anti-BSA IgG1behandelt.
  5. Waschen Sie Zelle Pellets einmal mit 2 mL PBS, jede verbleibende Anti-BSA aus den behandelten Zellen loszuwerden.
  6. Zelle Pellet in 600 µL des niedrigen Serum DMEM aufzuwirbeln.
  7. Von den 600 µL Zellsuspension aliquoten 200 µL in die vorher markierten 5 mL Rundrohr unten wie folgt:
    1. Nehmen Sie aus den unbehandelten Zellen 200 µL für Röhren beschriftet "unstimulierte", 200 µL für Röhren beschriftet "positiver Induktor" und 200 µL für Röhren beschriftet "positiver Induktor + Inhibitor"
    2. Aus der Anti-BSA IgG1 behandelte Zellen nehmen 200 µL für Röhren beschriftet "FcγR Vernetzung/FcγR XL" und 200 µL für Röhren beschriftet "FcγR XL + Inhibitor"
    3. Aus den unbehandelten Zellen für Entschädigung Steuerelemente verwendet werden, nehmen 200 µL für die Röhre beschriftet "unbefleckt unstimulierte", 200 µL für das "grüne + Induktor" Kontrolle und 200 µL für "Orange + Induktor" steuern.
      Hinweis: Wenn die Zellen von 5.7.1 und 5.7.3 aus derselben Maus abgeleitet sind, können die gleichen "unbefleckt unstimulierte" Zellen für das experimentelle und Entschädigung verwendet werden. Wenn nicht, eine zusätzliche 200 µL Zellen benötigt werden, für eine "Unbefleckte unstimulierte" experimentelle Steuerung für ein).
  8. Halten Sie die Rohre auf Eis bis Färbung und Stimulation. Während Serum Hunger und Bindung von IgG1, bereiten Sie die Sonden, bestimmte Reize und Induktoren wie unten beschrieben vor.
    Hinweis: Wenn den Test für die Durchführung zum erste Mal, wenn keine Vorlage verfügbar ist oder keine after-the-Fact Entschädigung gibt es auf der Durchflusszytometer und entsprechende Software, stimulieren und färben Entschädigung Kontrollen und führen Sie diese auf das Durchflusszytometer durchführen manuelle Kompensation vor Zugabe von Reizen zu experimentellen Proben.

6. Durchführung des Tests

  1. Bereiten Sie 2 x positiver Induktor Lösung durch Verdünnung 1: Pyocyanin 100 2 x Sonde Lösung (vorbereitet in Schritt 3,9) um ein 2 X-Konzentration von 500 µM von Pyocyanin zu erhalten (Endkonzentration werden 250 µM). Auch verdünnen Sie Pyocyanin 1: 100 in jeder der "2 x Sonde Lösung, nur grün" und "2 X Sonde Lösung, Orange nur" Röhren in 3.10 vorbereitet.
    Hinweis: Beide Bedingungen gekennzeichnet mit "positiver Induktor" und "positiver Induktor + Inhibitor" werden mit der positiven Induktor behandelt werden. Planen Sie entsprechend bei der Berechnung der Höhe 2 X positiver Induktor Lösung vorbereiten. Zum Beispiel: Wenn den Test mit 3 Mäuse durchführen, 6 Bedingungen (3 * 2) mit positiver Induktor behandelt werden, so bereiten 6 * 200 µL = 1,2 mL 2 x positiver Induktor Lösung.
  2. Bereiten Sie einen 2 x BSA Lösung durch Verdünnung der BSA-Stammlösung 2 x Sonde Lösung zu einer Konzentration von 2 µg/mL (Endkonzentration werden 1 µg/mL).
    Hinweis: Beide Bedingungen gekennzeichnet mit "FcγR XL" und "FcγR XL + Inhibitor" werden mit dem 2 x BSA Lösung behandelt werden. Planen Sie entsprechend bei der Berechnung der Lösung vorzubereiten. Zum Beispiel: Durchführung des Tests mit 3 Mäuse, 6 (3 * 2) Bedingungen behandelt werden, mit BSA-Lösung und so 6 * 200 µL oder 1,2 mL 2 x BSA Lösung benötigt werden.
  3. Stellen Sie bevor Sie beginnen die spezifische Stimulation (FcγR Vernetzung) sicher, dass die Reagenzien und Zellen bereit sind. Legen Sie die Rohre auf Eis in der Reihenfolge, dass sie angeregt werden.
  4. Für fließen Cytometers mit einem Autosampler, achten Sie auf die Zeit, die die Cytometer braucht, um eine Probe zu analysieren und auf den nächsten Zug einschließlich mischen und Sonde Waschschritten (z. B. 3,5 min).
    Hinweis: das Timing ist sehr entscheidend für diesen Test. Damit für jeden Zustand gut kontrolliert werden muss die Stimulation für die genaue Zeit (30 min) für jede Bedingung durchgeführt werden. Zellen zu stimulieren und die Verzögerungszeit zwischen Probe Übernahme durch das Durchflusszytometer zu integrieren. Zum Beispiel, wenn der Zeitaufwand für die Cytometer eine Probe zu analysieren und gehen Sie zum nächsten 3,5 min, stimulieren Sie Zellen in der Reihenfolge, wie, die Sie alle 3,5 Minuten analysiert werden.
  5. Wenn Sie manuelle Ausgleich zu diesem Zeitpunkt durchführen, stimulieren Sie Kontrollröhrchen Schadensersatz (Schritt 5.7.3) verwendet werden. Fügen Sie 200 µL "2 x Sonde Lösung, nur grün" Induktor (von 6,1) in die Röhrchen mit "grünen + Induktor" gekennzeichnet (Schritt 5.7.3). Fügen Sie 200 µL "2 x Sonde Lösung, Orange nur" Induktor (Schritt 6.1) in die Röhrchen mit "orange + Induktor" gekennzeichnet (Schritt 5.7.3).
  6. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° C, 5 % CO2 im Dunkeln.
  7. Mit Hilfe der Flow Cytometry Software generieren beschriften 3 Beispieldateien für die Kontrolle "unbefleckt," unbehandelt","grün + Induktor"und"orange + Induktor"Proben, um anzugeben, dass die Kanäle/Parameter werden analysiert (FSC, SSC, FL1, FL2) sicherstellen und Stop auf Wunsch Bedingungen (100 µL, 3 min, etc.). Generieren Sie und beschriften Sie einen ähnlichen Satz von Dateien für experimentellen Proben.
  8. Führen Sie das Beispiel "ungefärbten, unbehandelte". Öffnen Sie einen Dot-Plot für FSC (auf der x-Achse) Vs SSC (auf die y-Achse) und ein Tor zu ziehen, um die Zellen von Interesse, mit Ausnahme von abgestorbenen Zellen und Schutt (abgestorbene Zellen und Schmutz sind viel kleiner als die wichtigsten Zellenbevölkerung und erscheint unten links der Handlung).
  9. Mit Hilfe dieses "Zellen" Tor öffnen ein weiteres Dot-Plot der FL1 (x-Achse) Vs FL2 (y-Achse). Zeichnen Sie eine erste Quadrant-Tor. Einstellen Sie die Quadranten Tore so, dass die Ereignisse auf der unteren linken Quadranten des FL1 Vs FL2 Plot angezeigt werden.
  10. Führen Sie das Beispiel "grüne + Induktor". Passen Sie die Spannung, sodass die Ereignisse auf den unteren linken und rechten Quadranten der FL1 Vs FL2 Plot angezeigt werden. Gelten Sie diese Entschädigung Matrix für alle 3 Beispieldateien.
  11. Führen Sie das Beispiel "orange + Induktor". Die Spannung so einstellen, dass die Ereignisse am oberen und unteren erscheinen Quadranten des FL1 Vs FL2 Plots links. Gelten Sie diese Entschädigung Matrix für alle 3 Beispieldateien.
  12. Jede Entschädigung-Datei zu überprüfen und sicherzustellen, dass "unbefleckt, unbehandelt" Ereignisse auf den unteren linken Quadranten erscheinen, "grüne + Induktor" Ereignisse auf der unteren linken und rechten Quadranten werden und "orange + Induktor" Ereignisse am oberen und unteren erscheinen Quadranten des FL1 Vs links FL2 Grundstück. Gelten Sie die Vergütungsmatrix für alle experimentellen Beispieldateien.
    1. Damit eine angemessene Entschädigung für die Steuerdateien Probe angewendet wird, vor dem Auftragen der Entschädigung-Matrix für alle experimentellen Beispieldateien. Siehe Abbildung 2 für repräsentative Daten, die nicht kompensierten und korrekt kompensierten Proben.
      Hinweis: Viele Cytometers FL1 als standard-FITC/GLP Kanal (angeregt durch den blauen 488 nm Laser, und entdeckt mit einem 530/30 Filter-Set) und FL2 als standard PE-Kanal (aufgeregt durch den blauen 488 nm Laser, und entdeckt mit einem 585/40 Filter Set) festlegen. Wir verwenden diese Konvention aber Vorsicht Flow Cytometry Neueinsteiger, wenden Sie sich an ihren Flow Cytometry Kern Manager um sicherzustellen, dass ihre Cytometer entsprechend konfiguriert ist und dass die entsprechenden Kanäle verwendet werden, um diese Sonden zu erkennen. Je nach Modell Durchflusszytometer und begleitende Software kann es möglich sein, Entschädigung durchführen, bevor oder nachdem Proben erworben wurden. Wenn after-the-Fact Entschädigung möglich ist, kann die Entschädigung Schritt nach alle experimentelle Proben durch die Cytometer erworben wurden durchgeführt werden. Für Cytometers mit einem Dynamikbereich, wo PMT Spannung Anpassungen sind nicht erforderlich, eine Entschädigung Experiment kann auch an einem separaten Tag durchgeführt werden und die experimentelle Vorlage (einschließlich der Vergütungsmatrix) kann gespeichert werden, um die Verkürzung durchführen manueller Ausgleich.
  13. Sobald manueller Kompensation durchgeführt wurde und eine experimentelle Vorlage erhalten, beginnen Sie Behandlung der experimentellen Proben. Markieren Sie vor der Behandlung mit positiver Induktor oder FcγR Zellstimulation die Röhren ROS-Hemmer bekommen. Behandeln Sie diese Zellen mit ROS Inhibitor mindestens 30 min vor positiver Induktor oder FcγR Stimulation.
  14. Fügen Sie die ROS-Inhibitor, bereiten Sie eine Endkonzentration von 5 mM durch Zugabe von 1 µL des Inhibitors um 200 µL resuspendierte Zellen (ohne Anti-BSA IgG1).
  15. Behandlung der Zellen mit dem Reiz (oder positiver Induktor) und Wägezellen mit ROS-Sonden wie folgt:
    1. Für unstimulierte Zellen: 200 µL 2 x Sonde Lösung ohne jeden Anreiz zu 200 µL Zellsuspension beschriftet "gefärbt, unstimulierte" hinzufügen.
    2. Für die Positivkontrollen: 200 µL Zellsuspension beschriftet "positiver Induktor" oder "positiver Induktor + Inhibitor" 200 µL 2 x positiver Induktor Lösung (in Schritt 6.1 vorbereitet) hinzufügen.
    3. Für Zellen angeregt durch FcγR Vernetzung (bestimmten Stimulus): 200 µL Zellsuspension beschriftet "Fcγr XL" oder "FcγR XL + Inhibitor" 200 µL 2 x BSA Lösung (vorbereitet in 6.2) hinzufügen.
      Hinweis: Denken Sie daran, den Zeitabstand zwischen Probenanalyse durch Zugabe von Impuls alle X Minuten wobei x der Zeitabstand zwischen den Erwerb einer Probe ist zu integrieren.
  16. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° C, 5 % CO2 im Dunkeln. Analysieren Sie die Beispiele in der Reihenfolge, wie, die Sie angeregt mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem Autosampler waren. Verwenden Sie die Analysevorlagen, die während der anfänglichen Kompensationsstufen generiert. Waschen Sie Zellen vor der Analyse nicht.

(7) flow Cytometry Datenanalyse und erwartete Ergebnisse

  1. Innerhalb der Flow Cytometry Software, öffnen Sie die zuvor generierten Analysedateien für den experimentellen Proben (Vorlagen wurden in Schritten 6,7-6.12 generiert und Proben wurden im Schritt 6.16 laufen). Stellen Sie sicher, dass die Entschädigung Matrix von der Durchführung manuellen Kompensation auf der experimentellen Proben korrekt angewendet wurde.
    Hinweis: Fließen Cytometers und Flow Cytometry Software in der Lage, nach the Fact Entschädigung, wenn die Vergütungsmatrix nicht vorher auf die experimentelle Beispieldateien angewendet wurde, beantragen sie an dieser Stelle.
  2. Ähnlich wie bei der Überprüfung der richtigen manuellen Ausgleich sicherstellen, dass die Steuerelemente innerhalb der experimentellen Proben wie erwartet Verhalten.
    1. Sicherstellen Sie, dass die "ungefärbten, unbehandelte" Ereignisse werden am unteren linken Quadranten des FL1 Vs FL2 Plots, angezeigt, dass "positiver Induktor" Ereignisse zeigen erhöhte Fluoreszenz im linken oberen oberen rechten und unteren Rechte Quadranten des FL1 Vs FL2 Plot, und dass" positiver Induktor + ROS-Inhibitor"Ereignisse zeigen eine Reduzierung Fluoreszenz oben links, oben rechts und Rechte Quadranten des FL1 Vs FL2 Handlung im Vergleich zu der Fluoreszenz mit der"positiven Induktor"Probe beobachtet zu senken.
    2. Wenn Steuerelemente innerhalb der experimentellen Proben erhöhte Fluoreszenz nicht angezeigt werden, überprüfen Sie, ob alle Assay Schritte ausgeführt wurden, überprüfen Sie entsprechende Generation und Ansaugen von Knochenmark stammenden Makrophagen (2,7-2.19), und wiederholen Sie den Versuch. Wenn Steuerelemente innerhalb der experimentellen Proben die erwarteten Trends zeigen, gehen Sie, angeregt durch die FcγR (Abbildung 3A) experimentelle Proben zu analysieren.
  3. Überprüfen Sie, ob der FcγR-spezifischen Reiz angemessen funktioniert. Führen Sie die folgenden Beispiele von C57BL/6J WT Maus: "unbefleckt, unstimulierte", "gebeizt, unstimulierte", "gebeizt, angeregt durch die FcγR", und "gebeizt, angeregt durch die FcγR + ROS Inhibitor". Diese entsprechen den Proben 4.2a, 4.2 b, 4.2e und 4.2f im Abschnitt 4.
    1. Stellen Sie sicher, dass die "unbefleckt, unstimulierte" Veranstaltungen am unteren linken Quadranten des FL1 Vs FL2 Plots, angezeigt werden, dass "befleckt, unstimulierte" Veranstaltungen auch auf unteren linken Quadranten des FL1 Vs FL2 Plots, erscheint, dass "befleckt, angeregt durch die FcγR" Ereignisse zeigen erhöhte Fluoreszenz im linken oberen oberen rechten und unteren Rechte Quadranten des FL1 Vs FL2 Plot, und dass "befleckt, angeregt durch die FcγR + ROS Inhibitor" Ereignisse zeigen verringerte Fluoreszenz im oben links, oben rechts und unten rechts Quadranten der FL1 Vs FL2 Handlung im Vergleich zu den "stained, angeregt durch die FcγR" Probe (Abb. 3A).
    2. Wenn diese Erwartungen nicht erfüllt werden, beispielsweise das "stained, angeregt durch die FcγR" Beispiel zeigt minimale oder keine erhöhte Fluoreszenz im Vergleich zu den "gefärbt, unstimulierte" Muster oder "gefärbt, unstimulierte" Probe bereits zeigt deutlich erhöhte Spiegel von Fluoreszenz im Vergleich zu den "ungefärbten, unstimulierte" Probe, überprüfen Sie, ob alle Test-Schritte richtig ausgeführt wurden, überprüfen Sie entsprechende Generation, Grundieren und Handhabung von BMDMs (2,7-2.19), und wiederholen Sie den Versuch. Wenn diese Erwartungen erfüllt werden, fahren Sie mit der Analyse des Restes der experimentellen Proben.
      Hinweis: Zellen, die Produktion von ROS, die mit dem grünen Taster (Wasserstoffperoxid, Peroxynitrit, Hydroxyl-radikale, Stickstoffmonoxid, Peroxy radikale, etc.) reagieren erscheint in der oberen rechten und unteren Rechte Quadranten eines Protokolls FL1 (X-Achse) im Vergleich zu einem Protokoll FL2 (Y-Achse)-Dot-Plot. ROS, die mit der orange Sonde (weitgehend aber nicht ausschließlich Superoxid) reagieren produzierenden Zellen erscheint in den beiden oberen Quadranten eines Protokolls FL1 (X-Achse) im Vergleich zu einem Protokoll FL2 (Y-Achse)-Dot-Plot.
  4. Generieren Sie individuelle Histogramme, gated auf die Zellen von Interesse, für die Analyse der FL1- und FL2 Fluoreszenz. Mit "ungefärbten, unstimulierte" Proben, erzeugen Sie einen Histogramm Marker so, dass alle "ungefärbten, unstimulierte" Ereignisse auf der linken Seite dieser Marker angezeigt. Dieses Grundstück mit dem Marker auf den Rest der experimentellen Proben (Abb. 3 b) anwenden.
  5. Präsentieren Sie die Ergebnisse des Experiments als der Prozentsatz der positiven Zellen für jedes der ROS-Sonden oder zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der stimulierten Proben versus Kontrolle (Abbildung 3).

8. die Zelloberfläche Färbung in Kombination mit durchflusszytometrischen Analyse der ROS-Produktion (Optional)

Hinweis: Dieser Schritt liefert ein Protokoll zum Beizen von Makrophagen mit einer Zelloberfläche Markierung vor der Stimulation der FcγR und ROS Messung. Dies kann bei der Beurteilung der ROS-Produktion in gemischten Zellpopulationen nützlich sein. Es ist wichtig, wählen einen Antikörper für Makrophagen Oberfläche Marker konjugiert zu einer entsprechenden Fluor, die die Fluoreszenz von den oxidativen Stress oder Superoxid Nachweisreagenzen nicht stört. In diesem Protokoll wird ein Antikörper für die Maus, die F4/80 an Alexa Fluor 647 konjugiert verwendet.

  1. BMDMs zu erzeugen, zu ernten und prime sie wie zuvor beschrieben (§ § 1 und 2).
    Hinweis: Ein Minimum von drei 6 cm Platten sind erforderlich, um alle experimentelle Kontrollen und Auflagen wie unten beschrieben durchführen. Eine Platte wird mit Anti-BSA IgG1 behandelt werden, während Serum hungern, während die anderen beiden Platten übrig bleibt unbehandelt.
    1. Zählen Sie 4 experimentelle Kontrollen die Strömung durchflusszytometrischen Schadensersatz (pro Versuch) verwendet werden:
      (a) ungefärbten und unstimulierte Zellen.
      (b) Zellen behandelt mit den oxidativen Stress-Erkennung Reagenz (grüne Reagenz) und ROS-Induktor.
      (c) Zellen behandelt mit der Superoxid-Erkennung Reagenz (orange Reagenz) und ROS-Induktor.
      (d) Zellen gefärbt nur mit Anti-Maus, die F4/80 an Alexa 647 konjugiert.
    2. Gehören Sie für jede Maus oder biologische replizieren die folgenden 3 Bedingungen:
      (a) gebeizt mit F4/80 und links unstimulierte
      (b) mit F4/80 befleckt und aktiviert durch die FcγR
      (c) gebeizt mit F4/80 und durch die FcγR aktiviert und mit ROS-Inhibitor behandelt
  2. Nach dem Grundieren der Makrophagen über Nacht, den Überstand abgesaugt. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1-2 mL PBS. Serum verhungern die Zellen durch die Medien mit dem gleichen Volumen des niedrigen Serum DMEM ersetzen. Für jede Maus eine Platte mit Anti-BSA IgG1 während Serum hungern behandelt werden, während die beiden anderen Platten werden werden unbehandelt. Inkubieren Sie die Platten für 4 h bei 37 ° C, 5 % CO2.
  3. Nach Serum hungern Ernte der Zellen durch sanfte Kratzen oder mithilfe von 0,2 mM EDTA mit PBS-Puffer. Sammeln Sie jede Platte in beschrifteten 5 mL unten Rundrohre und Zentrifuge auf 750 X g für 5 min. welche Zellen den Überblick behalten wurden mit murine Anti-BSA IgG1behandelt.
  4. Waschen Sie Zelle Pellets einmal mit 1-2 mL PBS, jede verbleibende Anti-BSA aus den behandelten Zellen loszuwerden.
  5. Aufschwemmen eines Zelle Pellets von der Platte die nicht Anti-BSA IgG1 in 600 µL des niedrigen Serum DMEM bekommen. Diese Zellen werden nicht zur Zelle Oberfläche Färbung unterzogen werden. Verwenden Sie diese Entschädigung Steuerelemente. Aliquoten 200 µL dieser Zellsuspension in (3) 5 mL Runde Unterseite Röhren beschriftet (a) ungefärbten, unstimulierte b) grüne oxidativen Stress Reagenz, ROS-Induktor, (c) orange Superoxid Erkennung Reagenz + ROS-Induktor.
  6. Aufschwemmen eines der Zelle von der Platte die nicht Anti-BSA bekommen pellets1, in 300 µL Puffer Färbung Durchflusszytometrie IgG (PBS + 0,1 % FBS). Aliquoten 100 µL dieser Zellsuspension in (2) 5 mL Rundrohr unten zum Beizen mit Alexa 647 Anti-Maus F4/80.
  7. Aufschwemmen der Zelle Pellets aus der Platte, die Anti-BSA IgG1 in 300 µL Flow Cytometry Färbung Puffer zu erhalten. Aliquoten 100 µL dieser Zellsuspension in (2) 5 mL Rundrohr unten zum Beizen mit Alexa 647 Anti-Maus F4/80.
  8. Färben Sie die Zellen, die regelmÄÑig in 8.6 und 8.7, mit 5 µL Alexa 647 Anti-Maus F4/80 für 30 min auf Eis, in der Dunkelheit waren.
  9. Nach dem Färben, waschen Zellen durch Zugabe von 2 mL PBS und Zentrifuge bei 750 X g, Aspirieren des Überstands und jedes Rohr in 200 µL des niedrigen Serum DMEM ohne Phenol rot Aufschwemmen. Beiseite stellen eine unbehandelte Röhre als einzeln gefärbten FL4 Kontrolle dienen. Bereiten Sie Sonden, Induktor, FcγR Reiz und ROS-Inhibitoren, wie in den Abschnitten 3.9, 3.10, 6.1, 6.2 und 6.14 angegeben.
    1. Für Zellen, die nicht erhalten Anti-BSA1IgG, beschriften Sie Rohre mit den folgenden: ein) keine Anregung oder (b) ROS-Induktor.
    2. Für Zellen, die Anti-BSA erhielt1IgG, kennzeichnen Sie mit den folgenden: ein) Fc XL oder (b) Fc XL + Inhibitor.
  10. Stimulieren Sie die Proben für Entschädigung nach den jeweiligen Behandlungen verwendet werden, wie in 6,5-6.6, in der Reihenfolge angegeben, die sie auf das Durchflusszytometer, unter Einbeziehung der Zeitabstand zwischen den Erwerb einer Probe und die nächste gelesen werden.
  11. Inkubieren Sie die Zellen für 30 min bei 37 ° C, 5 % CO2 im Dunkeln. Analysieren Sie die Beispiele in der Reihenfolge, wie, die Sie angeregt mit einem Durchflusszytometer, ausgestattet mit einem Autosampler waren.
  12. Durchführen Sie manueller Ausgleich wie beschrieben in 6,7-6.12 und Datenanalyse, wie in Abschnitt 7 beschrieben.
  13. Verwendung der Flow Cytometry Software generieren und beschriften 4 Beispieldateien für das Steuerelement "unbefleckt, unbehandelt", "grüne"+"-Induktor", "Orange + Induktor" und "F4/80 befleckt" Proben, und achten Sie auf die Kanäle/Parameter zu geben analysiert (FSC, SSC, FL1, FL2, FL4) und gewünschten Stopp-Bedingungen (100 µL, 3 min, etc.).
  14. Laufen Sie die Proben und generieren Sie Punkt plottet, manuellen Kompensation durchzuführen.
    1. Für die Zelle Oberfläche beflecken, erzeugen zwei zusätzliche Grundstücke: FL1 (x-Achse) Vs FL4 (y-Achse) und FL2 (x-Achse) Vs FL4 (y-Achse). Passen Sie die Spannungen um sicherzustellen, dass angemessene Entschädigung angewendet wird, wie in Abbildung 7Agezeigt. Nachdem sämtliche Vergütungen ordnungsgemäß durchgeführt worden ist, gelten Sie die Vergütungsmatrix für alle experimentellen Beispieldateien.
  15. Sobald manueller Kompensation durchgeführt wurde und eine experimentelle Vorlage erhalten, beginnen Sie Behandlung der experimentellen Proben, wie in 6.13-6.15.3 und erwerben Sie Proben auf einem Durchflusszytometer zu, wie in 6.16 beschrieben.

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Ergebnisse

Unter Verwendung des Protokolls in umrissen, präsentieren wir Ihnen repräsentative Daten demonstrieren Fluss durchflusszytometrischen Erkennung der ROS-Produktion durch Stimulation der WT C57BL/6J BMDMs durch die FcγR. Wie erwartet, wir beobachten nur minimale Änderungen im FL1 oder FL2 Fluoreszenz über Hintergrund-Niveaus in unstimulierte Zellen (Abb. 3A, "gebeizt, unstimulierte" Vs "ungefärbten, unstimulierte" Dot Grundstücke zu vergleichen). Wir beobachten eine deutliche Steigerung FL1- u...

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Diskussion

RLKV2-DA und DHE-basierte Erkennung von ROS ist eine weit verbreitete Technik14,15. Einfache Bedienung und die Anpassungsfähigkeit der diese ROS-Sonden für kinetische Mikrotestplatte Formate hat Fluoreszenz-Mikroskopie oder Flow durchflusszytometrischen Analyse zu ihrer Beliebtheit beigetragen. Jedoch in unseren Studien FcγR-vermittelten Makrophagen Funktionen schien es kein Standardprotokoll für die Durchführung dieses Assays für durchflusszytometrisc...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten anderen Mitgliedern des Tigno-Aranjuez Labor einschließlich Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy und Roopin Singh für ihre Hilfe im Labor Unterhalt und Maus Kolonie Wartung danken. Unterstützung für diese Forschung lieferte Grant R00 HL122365 und Startkapital J.T.T-a.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-BSA IgG1Innovative ForschungIBSA9E2C2
Alexa Fluor 647 Ratte IgG2b, κ Isotyp Ctrl AntikörperBioLegend400626
Anti-Maus CD16/32BioLegend101302
Anti-Maus F4/80 Antikörper, konjugiert an Alexa Fluor 647BD Biosciences565853
Anti-Maus F4/80 Antikörper, konjugiert an FITCBioLegend123108
Anti-Maus/Mensch CD11b Antikörperkonjugiert an Alexa Fluor 647 BioLegend101218
Beta-Mercaptoethanol (BME)SigmaM3148-100ml
Rinderserumalbumin (BSA) FraktionVFisherBP1600-100
C57BL/6J JacksonLabs Best.-Nr. 000664
CM-H2DCFDAMolekulare SondenC6827Kann ein Ersatz für das Reagenz zur Detektion oxidativen Stresses im Enzo-Kit
sein Dihydroethidium (DHE)Molekulare SondenD11347Kann ein Ersatz für das Reagenz zur Erkennung von Superoxiden im Enzo-Kit
sein DMEM 1xCorning10-013-CV
DMEM ohne PhenolrotGibco31053-028
DMF wasserfrei Acros Organics61094-1000
Fötales Rinderserum (FBS)VWR97068-085
FITC Ratte IgG2a, κ Isotyp Ctrl AntikörperBioLegend400506
HEPES (1M)Gibco15630-080
L GlutaminGibco25030-081
LADMAC ZellenATCCCRL-2420
MEMCorning10-010-CV
Maus IFN-gGoldBio1360-06-100
N-Acetyl-L-CysteinEMD Milipore106425Kann ein Ersatz für den ROS-Inhibitor/Scavenger im Enzo-Kit sein
Novocyte-Durchflusszytometer mit AutosamplerAcea2060R
Pyocyanin (ROS-Induktor)Cayman chemisches10009594Kann ein Ersatz für den Induktor im Enzo-Kit sein
ROS-ID Gesamt-ROS/Superoxid-NachweiskitENZO ENZ-51010
Natriumpyruvat (100 mM)Gibco11360-070
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200-056

Referenzen

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