Isolierung von Lipoproteinpartikeln aus Hühnereigelb zur Untersuchung des bakteriellen Pathogens Fettsäure-Inkorporation in Membranphospholipide

Methicillin-resistente S. aureus (MRSA) ist die Hauptursache für gesundheitsbezogene Infektionen und die damit verbundene Antibiotikaresistenz ist eine erhebliche klinische Herausforderung^1,2,3. Daher hat die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien einen hohen Stellenwert. Eine vielversprechende Behandlungsstrategie für Gram-positive Krankheitserreger ist die Hemmung der Fettsäuresynthese, eine Anforderung für die Membranphospholipid-Produktion, die in S. aureusPhosphatidylglycerol (PG), Lysyl-PG und Cardiolipin⁴umfasst. Bei Bakterien erfolgt die Fettsäureproduktion über den Fettsäuresynthese-II-Signalweg (FASII) 5 ,^dersich erheblich vom eukaryotischen Pendant unterscheidet, was FASII zu einem attraktiven Ziel für die Antibiotikaentwicklung macht^5,6 . FASII-Inhibitoren zielen in erster Linie auf FabI ab, ein Enzym, das für die Ausdehnung der Fettsäure-Kohlenstoff-Kettendehnung⁷benötigt wird. Der FabI-Hemmer Triclosan wird in Konsumgütern und medizinischen Produkten weit verbreitet^8,9. Weitere FabI-Inhibitoren werden von mehreren Pharmaunternehmen zur Behandlung der S. aureus-Infektion^{entwickelt 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26}. Jedoch, viele Gram-positive Krankheitserreger, einschließlich S. aureus, sind in der Lage, exogene Fettsäuren für die Phospholipid-Synthese zu fangen, unter Umgehung FASII Hemmung^27,28,29. So wird das klinische Potenzial von FASII-Hemmern diskutiert, da wir über die Quellen von Wirtsfettsäuren und die Mechanismen, mit denen Krankheitserreger Fettsäuren aus dem Wirt extrahieren, erhebliche Lücken haben^27,28. Um diese Lücken zu schließen, entwickelten wir eine unvoreingenommene lipidomische Analysemethode, um die Einbindung exogener Fettsäure aus Lipoproteinpartikeln in Membranphospholipide von S. aureuszu überwachen.

Während der Sepsis stellen Wirtslipoproteinpartikel eine potenzielle Quelle von wirtabgeleiteten Fettsäuren innerhalb der Vaskulatur dar, da ein Großteil der Wirtsfettsäuren mit den Partikeln³⁰assoziiert ist. Lipoproteine bestehen aus einer hydrophilen Schale, die aus Phospholipiden und Proteinen besteht, die einen hydrophoben Kern von Triglyceriden und Cholesterinestern umschließen³¹. Vier Hauptklassen von Lipoproteinen - Chylomicron, Lipoprotein mit sehr geringer Dichte, Lipoprotein mit hoher Dichte und Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL) – werden vom Wirt hergestellt und fungieren als Lipidtransportfahrzeuge, die Fettsäuren und Cholesterin von und zu Wirtszellen über die Vaskulatur. LDLs sind reichlich in veresterter Fettsäure einschließlich Triglyceriden und Cholesterinester³¹. Wir haben bereits gezeigt, dass hochgereinigte menschliche LDLs eine lebensfähige Quelle von exogenen Fettsäuren für die PG-Synthese sind und somit einen Mechanismus für den FASII-Inhibitorbypass³²bieten. Die Reinigung menschlicher LDLs kann technisch anspruchsvoll und zeitaufwändig sein, während kommerzielle Quellen gereinigter menschlicher LDLs unerschwinglich teuer sind, um sie routinemäßig zu verwenden oder großangelegte bakterielle Bildschirme durchzuführen. Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir ein Verfahren zur Anreicherung von LDLs aus Hühnereigelb, einer reichen Quelle von Lipoproteinpartikeln³³, modifiziert. Wir haben erfolgreich ungezielte, hochauflösende/genaue Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometrie eingesetzt, um die Einbindung menschlicher LDL-Fettsäuren in die Membran von S. aureus³²zu überwachen. Im Gegensatz zu zuvor berichteten Methoden kann dieser Ansatz einzelne Fettsäure-Isomere für jeden der drei wichtigsten Staphylokokken-Phospholipid-Typen quantifizieren. Ölsäure (18:1) ist eine ungesättigte Fettsäure in allen Wirts-Lipoproteinpartikeln, die leicht in S. aureus phospholipide^29,30,32eingearbeitet werden kann. S. aureus ist nicht in der Lage, Ölsäure-Synthese²⁹; Daher stellt die Menge der phospholipidhaltigen Ölsäure das Vorhandensein von wirtlipoproteinabgeleiteten Fettsäuren in der Staphylokokkenmembran²⁹fest. Diese Phospholipid-Arten können durch die hier beschriebene hochmoderne Massenspektrometriemethode identifiziert werden, die eine beispiellose Auflösung der Membranzusammensetzung von S. aureus bietet, die in Gegenwart einer Fettsäurequelle kultiviert wird, die wahrscheinlich Begegnungen während der Infektion.

HINWEIS: Das folgende Protokoll zur Anreicherung von LDL-Partikeln aus Hühnereigelb stammt von Moussa et al. 2002³³.

1. Herstellung von Hühnereigelb zur Anreicherung von LDL-Partikeln

1. Zwei große Hühnereier durch Waschen der Schalen mit 70% Ethanollösung sanieren und lufttrocknen lassen.
2. Den Eiabscheider mit 70% Ethanollösung desinsieren und lufttrocknen lassen. Befestigen Sie den Eiabscheider an der Lippe eines mittelgroßen Bechers.
3. Knacken Sie jedes Ei einzeln in den Eiabscheider und lassen Sie das Albumin in den Becher fließen. Das intakte Eigelb wird vom Separator zurückgehalten.
4. Waschen Sie das Eigelb zweimal mit 30 ml steriler Phosphat-gepufferter Kochchen (PBS), um Restalben zu entfernen.
5. Das Eigelb vorsichtig auf Filterpapier legen.
6. Punktieren Sie die Vitelline-Membran mit einer sterilen Pipettenspitze und entleeren Sie den Inhalt der Membran in ein steriles 50 ml konisches Zentrifugenrohr. Entsorgen Sie die Membran und das Filterpapier.

2. Fraktionierung von LDL-haltigem Plasma aus Hühnereigelb

1. Etwa zwei Volumina von 0,17 M NaCl bei pH 7,0 in das Eigelb geben und kräftig vermischen. Dann mischen Sie diese Lösung bei 4 °C für 60 min.
2. Zentrifugieren Sie die Eigelbverdünnung bei 10 °C bei 10.000 x g für 45 min. Entfernen Sie die Plasmafraktion (Überstand) aus der körnigen Fraktion (Pellet) in ein steriles 50 ml kegelförmiges Rohr.
3. Wiederholen Sie Schritt 2.2.

3. Isolierung von LDL-Partikeln aus Plasma

1. Mischen Sie die Plasmafraktion mit 40% Ammoniumsulfat (w/v) bei 4 °C für 60 min.
2. Stellen Sie den pH-Wert der Plasmafraktion mit einer 420 mM NaOH-Lösung auf 8,7 ein.
3. Zentrifugieren Sie die Eigelbverdünnung bei 4 °C bei 10.000 x g für eine Dauer von 45 min. Entfernen Sie die obere halbfeste gelbe Fraktion in 7 kDa Poren-Durchmesser Dialyseschläuche. Geben Sie Platz in den Schläuchen, damit sie anschwellen.
4. Dialyze über Nacht bei 4 °C in 3 L Reinstwasser, um das Ammoniumsulfat zu entfernen. Rühren Sie das Wasser vorsichtig mit einer Rührstange.
5. Dialyzierte Lösung in ein steriles 50 ml konisches Zentrifugenrohr übertragen.
6. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 4 °C bei 10.000 x g für eine Dauer von 45 min. Entfernen Sie die obere halbfeste gelbe Fraktion vorsichtig in ein steriles Rohr und lagern Sie sie bei 4 °C.

4. Bewertung von Hähnchen-LDLs als Quelle von Fettsäuren

1. Subkultur S. aureus Zellen in 5 ml fettsäurefreie 1% Tryptonbrühe und über Nacht bei 37 °C mit Schütteln (225 U/min) brüten. Bei Fettsäure-Auxotrophen, ergänzen Kulturen mit einer Quelle von Fettsäuren.
2. Übernachtkulturen auf eine optische Dichte (OD) bei 600 nm (OD₆₀₀) von 0,1 in 1% Tryptonbrühe verdünnen. Pipette 50 l der Zellsuspension in jeden Brunnen einer runden 96-Well-Platte.
   HINWEIS: Bei der Arbeit mit Fettsäure-Auxotrophen, waschen Sie die Nachtkulturen in zwei Volumina von Tryptonbrühe und resuspendieren in 5 ml Tryptonbrühe, um die Übertragung von Fettsäuren zu begrenzen, bevor Sie die OD der Kultur bestimmen.
3. Für die Brunnen, die unbehandelte Kontrollen enthalten, fügen Sie 50 l von 1% Tryptonbrühe pro Brunnen hinzu.
4. Zu den Brunnen, die die experimentellen Zellsuspensionen enthalten, fügen Sie 50 l 1% Tryptonbrühe hinzu, ergänzt mit 10% Eigelb-abgeleitetem LDL, 2 'M Triclosan, oder einer Mischung aus 10% Eigelb-abgeleitetem LDL und 2 'M Triclosan.
   HINWEIS: An dieser Stelle wird jeder Brunnen 100 l enthalten, und die endgültige Konzentration von LDL und Triclosan aus Eigelb pro Bohrgut beträgt 5 % bzw. 1 M.
5. Messen Sie OD₆₀₀ im Zeitverlauf mit einem Mikroplattenleser, der auf 37 °C eingestellt ist, mit kontinuierlichem, linearem Schütteln, um das Wachstum zu überwachen.

5. Inkubation von S. aureus mit LDLs zur Membranlipidanalyse.

1. Kultur eine isolierte Kolonie in 5 ml fettsäurefreie 1% Tryptonbrühe und über Nacht bei 37 °C mit Schütteln (225 Rpm) bebrüten.
2. Übernachtkulturen 1:100 in einen sterilen 250 ml verwirrten Kolben mit 50 ml 1% Tryptonbrühe verdünnen. Inkubieren bis Mitte-Log-Phase (ca. 4 h) bei 37 °C mit Schütteln.
3. 25 ml Kultur in ein steriles 50 ml Zentrifugenrohr übertragen und die Zellen pelleten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 750 l von 1% Tryptonbrühe wieder auf.
4. Kombinieren Sie die resuspendierten Zellen und aliquot 300 l der Zellsuspension in einem sterilen 1,5 ml Zentrifugenrohr.
5. LDLs der gewünschten Endkonzentration hinzufügen und bei 37 °C mit Schütteln (225 Rpm) für 4 h inkubieren.
6. Zentrifugieren Sie die Kulturen bei 4 °C bei 16.000 x g für eine Dauer von 2 min und waschen Sie die Zellpellets in zwei Bänden steriler PBS und wiederholen Sie sie dann.
7. Zeichnen Sie das Gewicht jedes Nasszellpellets auf. Fangen Sie die Zellpellets auf Trockeneis oder in flüssigem Stickstoff einund und lagern Sie sie bei -80 °C oder fahren Sie direkt zu Abschnitt 6 über.

6. Extraktion von S. aureus Membranlipiden

1. Gefrorene S. aureus-Zellpellets auf Trockeneis legen. Fügen Sie 0,5 mm Zirkonoxid-Perlen auf jedem Zellpellet hinzu, wobei ein Volumen von Perlen verwendet wird, das ungefähr dem Volumen des Zellpellets entspricht.
   HINWEIS: Als Alternative zu dieser Methode der Lipidextraktion können Forscher die etablierten Bligh- und Dyer-oder Folch-Methoden zur Exaktisierung von Lipiden aus Bakterienzellen 34 verwenden.
2. 740 L 75% Methanol (HPLC-Grade) auf -80 °C gekühlt direkt in die Zellpellets geben.
3. Fügen Sie als internen Standard 2 l von 50 'M Dimyristoylphosphatidylcholin (in Methanol hergestellt) pro 1 mg Zellen hinzu. Schließen Sie das Reagenzglas und legen Sie die 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, die jede Probe enthalten, in einen verfügbaren Port in einem Bullet Blender Gewebehomogenisator. Homogenisieren Sie die Proben bei niedriger Geschwindigkeit, Einstellung 2-3, für 3 min.
4. Überprüfen Sie die Proben visuell auf Homogenität. Wenn Zellklumpen sichtbar sind, fahren Sie mit der Homogenisierung im Bullet Blender in Schritten von 2 Minuten fort.
5. Entfernen Sie die Proben von Bullet Blender und übertragen Sie sie auf eine chemische Dunstabzugshaube.
6. Fügen Sie jedem Probenröhrchen 270 l Chloroform hinzu. Wirbeln Sie die Proben 30 min kräftig.
   VORSICHT: Chloroform ist ein mögliches Karzinogen.
7. Zentrifugieren Sie die Proben in einer Tischzentrifuge für bis zu 30 min bei mindestens 2.000 x g. Mit kompatiblen Zentrifugenrohren können schnellere Geschwindigkeiten verwendet werden und die Zentrifugationsdauer kann auf 10 min verkürzt werden.
8. In einer chemischen Rauchhaube sammeln Sie den monophasischen Überstand und übertragen Sie ihn in ein neues Reagenzglas, während Sie das Proteinpellet am Boden des Extraktionsrohrs sorgfältig vermeiden.
9. Fügen Sie dem Proteinpellet 740 l 75 % Methanol (HPLC-Gehalt) und 270 l Chloroform hinzu, und extrahieren Sie jede Probe wie in den Schritten 6.6-6.8 beschrieben erneut. Kombinieren Sie den Überstand aus der zweiten Extraktion mit dem zuvor gesammelten Überstand für jede Probe.
10. Verdampfen Sie die Extraktionslösungsmittel unter einem Strom von inertem Gas wie Stickstoff oder Argon oder unter Vakuum mit einem Zentrifugenkonzentrator (Materialtabelle).
11. Getrocknete Lipidextrakte dreimal mit 1,0 ml wässriger 10 ml Ammoniumbicarbonatlösung waschen und die Proben wie in Schritt 6.10 erneut trocknen.
12. Die getrockneten Lipidextrakte in einem geeigneten unpolaren Lösungsmittel wie Isopropanol aussetzen. Resuspend Proben mit 20 l pro 1 mg Frischzellengewicht in Schritt 5.7 Alternativ, wenn das Gewicht der Zellpellets unbekannt ist, setzen Sie die Proben in 200 l Isopropanol wieder auf und fahren Sie mit Abschnitt 7 fort.

7. Analyse von S. aureus Lipidprofilen mit hoher Auflösung/genauer Massenspektrometrie

1. Bevor Eine vollständige Lipidanalyse durchgeführt wird, wählen Sie repräsentative Testproben aus der/den versuchsexperimentellen Gruppe(n) aus und analysieren sie über einen Bereich von Probenverdünnungsfaktoren, um Probenverdünnungsbereiche zu bestimmen, in denen die gesamten Lipidkonzentrationen innerhalb der linearen Bereich des Detektor-Ansprechens für das Massenspektrometer, wie zuvor beschrieben³⁵.
2. Verdampfen Sie Aliquots jedes Probenfettextrakts, der einer Lipidanalyse unterzogen werden soll, indem die Aliquots unter Inertgas oder unter Vakuum in einem Zentrifugenkonzentrator getrocknet werden (Materialtabelle).
3. Setzen Sie jeden getrockneten Lipidextrakt in der flüssigen Chromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) isopropanol:methanol (2:1, v:v) mit einem 20 mM Ammoniumformat auf, wobei Volumen verwendet werden, die einem optimalen Probenverdünnungsfaktor entsprechen, wie in Schritt 7.1 bestimmt.
4. Für eine ungezielte Lipidanalyse können Proben direkt in die hochaufgelöste/genaue Massenspektrometrieplattform eingeführt werden, ohne dass eine Chromatographie durch Durchflussinjektion oder direkte Infusion der Extrakte^35,36verwendet wird. Die in Schritt 7.3 hergestellten verdünnten Lipidextrakte in eine geeignete Autosampler-Durchstechflasche oder 96-Well-Platte geben.
5. Für die Strömungsinjektions-basierte Analyse, legen Sie die Autosampler-Durchstechflaschen in einen temperaturgeregelten (15 °C) Autosampler eines HPLC-Systems, das Kapillar-/Low-Flow-Anwendungen wie einen HPLC (Table of Materials) mit einem elektronischen Durchfluss Proportionierungs- und Durchflussüberwachungssystem.
6. Füllen Sie die HPLC-Lösungsmittelbehälter mit LC-MS-Isopropanol:Methanol (2:1, v:v) mit 20 mM Ammoniumformat.
7. Mit der Software Agilent Chemstation programmieren Sie den HPLC-Autosampler, um 5 L-Probeninjektionen durchzuführen. Wählen Sie im Menü Instrument in das Feld Injektor einrichtenaus, und geben Sie 5.0 in das Feld Injektionsvolumen ein. Die Einheiten werden als Mikroliter angegeben. Stellen Sie sicher, dass der HPLC auf einen isokratischen Durchfluss von 2:1 (v:v) Isopropanol:Methanol mit einem 20 mM Ammoniumformat eingestellt ist.
8. Wählen Sie im Menü Chemstation Instrument die Option Pumpe einrichten... und dann den Schalter Für den Micro Flow-Modus.
9. Geben Sie in die Felder Zeitplan ein: Zeit 0.00, 100% B, Flow 1.0. Drücken Sie enter enter and create a second row in the Timetable by entering Time 10.0, 100% B, Flow 1.0. Wählen Sie die Schaltfläche OK am unteren Rand des Menüs Pumpe einrichten aus. Diese Einstellungen ermöglichen 10 analytische Durchläufe mit einer Durchflussrate von 1,0 l pro Minute.
10. Führen Sie Eluat von der HPLC-Transferleitung in das Massenspektrometer ein, indem Sie eine Elektrospray-Ionisationsquelle verwenden, die mit einer stromarmen (34 G) Metallnadel ausgestattet ist.
11. Wählen Sie mit der Thermo Tune Plus Instrumentensteuerungssoftware das Setup-Menü und beheizte ESI-Quelleaus. Stellen Sie die Ionisationsspannung auf 4000 V und das Mantelgas auf 5 (willkürliche Einheiten) ein, indem Sie diese Werte in die entsprechenden Felder des Dialogfeldes eingeben. Stellen Sie die Kapillartemperatur auf 150 °C und die S-Linse auf 50 % ein.
    HINWEIS: Diese Werte müssen für jede Massenspektrometrieplattform optimiert werden.
12. Verwenden Sie für die ungezielte Lipidanalyse eine hochauflösende/genaue Massen-MS-Plattform (Tabelleder Materialien) als Detektor.
13. Klicken Sie mit der Thermo Tune Plus-Software auf die Schaltfläche Scan definieren, und wählen Sie im Menü Analyzer FTMSaus. Legen Sie das Feld Massenbereich auf Normal fest, und wählen Sie im Feld Auflösung 100.000aus. Stellen Sie sicher, dass der Scantyp auf Vollfestgelegt ist. Geben Sie im Menü "Bereiche scannen" 200 in das Feld Erste Masse (m/z) und 2000 in das Feld Letzte Masse (m/z)ein.
14. Stellen Sie sicher, dass die negative Polarität verwendet wird, um die am häufigsten vorkommenden S. aureus Lipide zu erkennen.
15. Wiederholen Sie die Probenanalyse mit Derion-Mapping-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Fragmentierung aller Lipidionen innerhalb eines spektralen Bereichs von Interesse, um Lipidstrukturen und Fettsäurebestandteile zu bestätigen. Alternativ können ausgewählte Lipidionen von Interesse einer MS/MS-Analyse unterzogen werden, nachdem in Abschnitt 8 erste Lipididentifikationen zugewiesen wurden.

8. Datenbanksuche zur Identifizierung endogener S. aureus und exogener LDL-abgeleiteter Lipide

1. Verwenden Sie die Thermo Xcalibur-Software, um die beobachtete Massengenauigkeit weiter zu verfeinern. Wählen Sie in Xcalibur im Menü Extras die Option Offline neu kalibrierenaus. Nachdem das Fenster Offline neu kalibriert geöffnet wurde, laden Sie die Massenspektrumdatei, die neu kalibriert werden soll, indem Sie das Menü Datei auswählen und die Option Öffnen auswählen.
2. Öffnen Sie die Interessendatei, umschalten Sie die Schaltfläche Zeile einfügen am oberen Rand des Ansichtsfensters, um das gesamte Ionenchromatogramm für die MS-Ausführung anzuzeigen. Durchschnittlich die erfassten MS-Signale, indem Sie mit der linken Maus auf eine Kante des beobachteten Signalspitzen im gesamten Ionenchromatogramm klicken und die Maus über den breitesten Teil der Peak ziehen.
3. Wählen Sie im Menü Scanfilter den Filter aus, der den vollständigen Scan-MS-Daten entspricht. Laden Sie eine Referenzdatei mit den theoretischen monoisotopischen Massen von mindestens drei bekannten S. aureus endogenen Lipiden, indem Sie die Schaltfläche Load Ref... und die Referenzdatei auswählen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Verwenden neben jeder monoisotopischen Lipidmasse.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen am unteren Rand des Anzeigefensters. Durchschnittlich wird das MS-Signal über die Signalspitze im gesamten Ionenchromatogramm wie zuvor neu gemittelt.
5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Konvertieren am unteren Rand des Anzeigefensters. Wenn das Feld Dialog konvertieren geöffnet wird, klicken Sie auf OK. Lassen Sie diesen Schritt weg, wenn Daten auf Massenspektrometrieplattformen von anderen Anbietern als Thermo Scientific gesammelt wurden.
6. Exportieren Sie mithilfe der Xcalibur-Software die neu kalibrierten genauen Massenspitzenlisten für jedes unbehandelte oder Mit LDL behandelte Beispiel in separate Arbeitsblätter einer Excel-Datei. Wählen Sie das Symbol Qual Browser aus. Öffnen Sie die neu kalibrierte Datei von Interesse, indem Sie das Menü Datei auswählen und die Option Öffnen... auswählen.
7. Durchschnittlich es das Signal über den breiten Peak im gesamten Ionenchromatogramm, wie in Schritt 8.2 beschrieben.
8. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Thumbtack-Symbol im Anzeigefenster des Massenspektrums, und wählen Sie Ansicht | Spektrumliste. Wählen Sie im gleichen Menü Anzeigeoptionen und dann alle Peaks-Umschaltbox im Menü Anzeige aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um das Anzeigefenster zu schließen.
9. Klicken Sie mit der rechten Maustaste erneut auf das Thumbtack-Symbol im Anzeigefenster des Massenspektrums, und wählen Sie die Option Exportieren | Zwischenablage (Genaue Masse). Fügen Sie die exportierte Datenzelle A1 des ersten Arbeitsblatts in eine neue Excel-Tabelle ein.
10. Löschen Sie die ersten 8 Textzeilen in der exportierten Datendatei, sodass Zelle A1 der Excel-Tabelle den ersten Massendatenpunkt aus dem Massenspektrum enthält. Wiederholen Sie den Export jeder neu kalibrierten MS-Datei mithilfe eines neuen Arbeitsblatts in der Excel-Datei für jede exportierte Spitzenliste.
11. Erstellen Sie mit der Software Lipid Mass Spectral Analysis (LIMSA)³⁷ Add-In für Excel eine Datenbank mit molekularen Formeln bekannter S. aureus-Lipidarten, wie von Hewelt-Belka etal. 2014³⁸beschrieben, sowie Formeln, die Lipidarten darstellen, die hypothetisch in LDL vorhanden sein könnten.
    HINWEIS: Darüber hinaus sollte darauf geachtet werden, potenzielle molekulare Formeln in die Datenbank für hypothetische bakterielle Lipide aufzunehmen, die wichtige LDL-Fettsäuren wie Öl (18:1) und Linolsäuren (18:2) Fettsäuren³²enthalten haben.
12. Um die Datenbank zu erstellen, öffnen Sie eine leere Excel-Tabelle. Geben Sie in Zelle A1 des ersten Arbeitsblatts die theoretische/berechnete monoisotopen Masse der Lipidart ein, die der Datenbank hinzugefügt werden soll, entsprechend der Masse der Lipidart im ionischen Zustand, die im Massenspektrometer beobachtet wird. Geben Sie in Zelle B1 einen Namen für die Lipidart ein, z. B. PG(34:0).
13. Geben Sie in Zelle C1 die Molekularformel für die Lipidart ein, die dem ionischen Zustand des Lipids entspricht, der im Massenspektrometer beobachtet wird. Geben Sie in Zelle D1 die Ladung der Lipidart ein, wie sie im Massenspektrometer beobachtet wird. Wechseln Sie zu Zelle A2, um einen neuen Eintrag für die nächste Lipidart zu beginnen, die in die durchsuchbare Datenbank eingegeben werden soll.
14. Wiederholen Sie die Schritte 8.12 und 8.13, bis alle gewünschten Lipidarten in die Datenbank eingegeben wurden. Speichern Sie die Datenbankdatei, und lassen Sie sie in Excel geöffnet.
15. Wählen Sie in Excel das Add-In-Menü in aus. Wählen Sie LIMSA, um die LIMSA-Software zu starten. Klicken Sie im Hauptmenü auf die Schaltfläche Verbundbibliothek.... Klicken Sie im neuen Fenster, das angezeigt wird, auf Verbindungen importieren. Dadurch wird die zusammengesetzte Datenbank zur Verwendung durch die LIMSA-Software hochgeladen.
16. Führen Sie genaue massenbasierte Lipid-Identifikationen auf allen MS-Spektren mit dem LIMSA-Software-Add-In für Excel gemäß den Anweisungen des Herstellers³⁵durch. Wählen Sie im LIMSA-Hauptmenü Peak List im Menü "Spektrumtyp" aus. Wählen Sie Den Positivmodus oder den Negativmodus aus, um der Polarität zu entsprechen, in der die MS-Daten erfasst wurden.
17. Geben Sie im Fenster Peak fwhm (m/z) das gewünschte Massensuchfenster für die Peak-Suche ein. Für hochauflösende/genaue Massen-MS-Daten wird ein Massentoleranz-Suchfenster von 0,003-0,005 m/z empfohlen.
18. Geben Sie im Sensitivitätsfenster den gewünschten Basislinien-Cutoff ein (z. B. 0,01 % relative Häufigkeit). Wählen Sie im Menü Isotope-Korrektur Algorithmen linear anpassen oder subtrahieren aus, die beide mit Spitzenlistendaten verwendet werden können.
19. Markieren Sie Lipidverbindungen, die in die Datenbanksuche aufgenommen werden sollen, indem Sie im Fenster Verfügbare Verbindungen auf die gewünschten Lipidarten klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen, um der Suchgruppe hervorgehobene Lipidarten hinzuzufügen.
20. Definieren Sie interne Standards, indem Sie auf zugesetzte Verbindungen klicken und dann das Konzentrationsfenster auf die entsprechende Konzentration des ausgewählten internen Standards ändern.
21. Stellen Sie sicher, dass der interne Standard und die ausgewählten Lipidarten, die quantitiert werden sollen, zum gleichen Klassennamen gehören, indem Sie jede hinzugefügte Lipidart und jeden internen Standard auswählen und einen Klassennamen (z. B. PG oder Lipid) in das Feld Klasse eingeben.
22. Um die durchsuchbare Gruppe von Lipidverbindungen für die zukünftige Verwendung zu speichern, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern neben dem Menü Gruppen.
23. Stellen Sie sicher, dass die Excel-Datei mit allen exportierten MS-Spitzenlisten für das Blatt geöffnet ist, das der ersten S. aureus MS-Ausführung entspricht, und klicken Sie dann im LIMSA-Hauptmenü auf die Schaltfläche Suchen.
    ANMERKUNG: Die Ausgabe der LIMSA-Datenbanksuche enthält eine Liste der Massenspektralfeatures, die mit Lipiden in der datenbankbasierten Datenbank übereinstimmen, die in den Schritten 8.12-8.13 erstellt wurde, sowie Konzentrationen für jedes übereinstimmende Feature nach der Normalisierung auf eine oder mehrere ausgewählte interne Standards.
24. Verwenden Sie die Xcalibur-Software, um genaue Massen-MS/MS-Spektren für m/z zu untersuchen, die Lipidionen von Interesse entsprechen, um Fettsäurebestandteile zu bestätigen, die in jeder identifizierten Lipidmolekülart vorhanden sind. Wählen Sie das Symbol Qual Browser aus. Öffnen Sie die von Interesse sindde MS/MS-Datei, indem Sie das Dropdown-Menü Datei auswählen und die Option Öffnen... auswählen.
25. Wählen Sie den Scanfilter entsprechend der MS/MS-Analyse eines Lipids m/z von Interesse, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Thumbtack-Symbol im Anzeigefenster des Massenspektrums klicken, und wählen Sie Bereiche aus dem Menü aus. Wählen Sie im neuen Angezeigten das Menü Filter aus, um den Scan auszuwählen.
26. Durchschnittlich es das Signal über das gesamte Ionenchromatogramm, wie in Schritt 8.2 beschrieben. Verwenden Sie die Software MetaboAnalyst (www.metaboanalyst.ca), um geeignete statistische Tests durchzuführen. Bewerten Sie statistisch signifikante Unterschiede in der S. aureus Lipidzusammensetzung, indem Sie normalisierte Lipidhäufigkeiten über unbehandelte und LDL-behandelte Bedingungen vergleichen.

Das Protokoll zur Anreicherung von LDL aus Hühnereigelb ist in Abbildung 1dargestellt. Dieser Prozess beginnt mit der Verdünnung von ganzem Eigelb mit Kochchen und der Trennung der Eigelbfeststoffe, die als Granulat bezeichnet werden, von der löslichen oder Plasmafraktion, die die LDLs enthält (Abbildung 1)33. Der LDL-Gehalt der Plasmafraktion wird durch die Ausfällung der 30-40 kDa-Livetine (Abbildung2)33weiter angereichert. Das Vorhandensein von Proteinbändern bei 140, 80, 65, 60 und 15 kDa korreliert mit den Apoproteinen von LDLs (Abbildung 2)33,39. Die Behandlung mit Triclosan hemmt das Wachstum von S. aureus in fettsäurefreien Medien32. Wir haben bereits gezeigt, dass die Ergänzung von Kulturen mit Eigelbplasma oder gereinigten menschlichen LDLs als exogene Fettsäurequellen die triclosan-induzierte Wachstumshemmung überwindet (Abbildung 3)32. In ähnlicher Weise stellt die Supplementierung von triclosan behandelten Kulturen mit angereichertem Eigelb LDL das Wachstum wieder her (Abbildung 3). Darüber hinaus unterstützt die Zugabe von Eigelb LDLs das Wachstum einer zuvor charakterisierten S. aureus Fettsäure-Auxotroph (Abbildung 4)32. Für die genaueste Massenspektrometrie-basierte Profilierung von S. aureus Inkorporation von exogenen Fettsäuren ist es wichtig, das Vorhandensein von freien Fettsäuren im Wachstumsmedium zu begrenzen. Die freie Fettsäurezusammensetzung von 1% Tryptonbrühe und Hühnereigelb LDLs, die in Tryptonbrühe verdünnt wurden, wurde durch den Einsatz von Strömungsinjektion enthonen/präzisen Massenspektrometrie bestimmt und fand minimale Mengen an freier Fettsäure (Abbildung 5). Die gleiche ungezielte Massenspektrometrie-Analyse wurde durchgeführt, um die Fettsäurezusammensetzung von S. aureus Phospholipiden nach Exposition gegenüber Hühnereigelb LDLs zu bestimmen. Orthogonale partielle kleinste Quadrate Diskriminantanalyse (OPLS-DA)40 der reichlich vorhandenen S. aureus Membran Phospholipide zeigten eine klare Klassentrennung von unbehandelten und Hühnereigelb LDL-behandelten Bedingungen, wie in der OPLS-DA-Scores-Diagramm gezeigt (Abbildung 6A). Das OPLS-DA-Ladediagramm zeigte zahlreiche Phosphatidylglycerolarten als wichtige Variablen im PLS-DA-Modell an. Insbesondere Phospholipide, die ungesättigte Fettsäuren enthalten, ein molekularer Marker der exogenen Fettsäure-Inkorporation, werden in den LDL-ergänzten Kulturen im Vergleich zu Zellen angereichert, die in Abwesenheit von LDLs inkubiert werden (Abbildung 6B). Frühere Studien haben herausgefunden, dass Hühnereigelb eine reiche Quelle von ungesättigten Fettsäuren mit Ölsäure (18:1) ist die am häufigsten vorkommende41,42. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen fanden wir Ölsäure die häufigste ungesättigte Fettsäure für die Phospholipidsynthese verwendet, wenn S. aureus Kulturen wurden mit Hühnereigelb LDLs ergänzt (Abbildung 6C). Tabelle 1 zeigt ferner, dass die Fettsäureprofile von Membranphospholipiden verändert werden, wenn S. aureus in Gegenwart von Eigelb LDL angebaut wird.

Abbildung 1: Eine Abbildung der LDL-Anreicherung aus Hühnereigelb unter Verwendung von Zentrifugation und Ammoniaksulfatfällung. (A) Die für die Anreicherung von LDL aus Hühnereigelb erforderlichen Reagenzien. (B) Das Flussdiagramm zeigt die wichtigen Schritte des LDL-Anreicherungsprozesses. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Proteinprofil von Hühnereigelb vor und nach der Anreicherung für LDL. Proteinlysate wurden mit RIPA-Puffer hergestellt. Proteinlysat (15 g) wurde in ein 8% Acrylamid SDS-PAGE Gel geladen. Gele wurden über Nacht mit Bio Rad Protein Reagenz gefärbt. Die Molekulargewichte in kDa von LDL assoziierten Proteinen werden entlang der rechten Seite des Bildes bezeichnet. M: Proteinmarker, Y: Hühnereigelb und LDL: Hühnereigelb LDL-Anreicherung Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Eigelb-abgeleitete LDLs schützen S. aureus vor triclosan-induzierter FASII-Hemmung. Das Wachstum von S. aureus wurde im Laufe der Zeit durch Messung von OD600 in 1% Tryptonbrühe unter folgenden Bedingungen überwacht: 1% Tryptonbrühe (TB), 1 M Triclosan (TCS), 1 M Triclosan mit 1% Eigelbplasma (TCS + EYP), 5% Eigelb LDL (LDL) oder 1 Triclosan mit 5% Eigelb LDL (TCS + LDL). Der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten wird gezeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Wachstum eines S. Aureus Fettsäure Auxotroph wird durch Eigelb abgeleitetl LDL unterstützt. Das Wachstum eines Fettsäure-Auxotrophs in 1% Tryptonbrühe (TB) mit oder ohne 5% Eigelb LDL (LDL) Supplementierung wurde im Laufe der Zeit durch Messung von OD600überwacht. Der Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten wird gezeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Freier Fettsäuregehalt gemessen in 1% Tryptonbrühe oder Hühnereigelb LDL. Freie Fettsäuren wurden durch Durchflussinjektion hochauflösende/genaue Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometrie nachgewiesen. Normalisierte Anzahl von Ionen pro mg Protein wurde für 1% Tryptone Brühe und 1% Tryptone Brühe ergänzt mit 5% Huhn Eigelb LDLs bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Chicken Eigelb Mit geringer Dichte Lipoproteine sind ein Reservoir von exogenen Fettsäuren für die Synthese von S. aureus phosphatidylglycerol. (A) Scores-Diagramm von orthogonalen partiellen kleinsten Quadraten diskriminant Analyse von Hühnereigelb LDL-behandelt und unbehandelt S. aureus Membran Phospholipide identifiziert mit hoher Auflösung / genaue Massenspektrometrie. (B) Prozentsatz des ungesättigten Phosphatidylglycerols (UPG) im Vergleich zur Gesamtmembran PG von S. aureus, die in Abwesenheit (WT) oder Anwesenheit (WT + LDL) von Hühnereigelb LDLs angebaut werden. (C) Ungesättigte Fettsäure (UFA) Profil der Membran PG von S. aureus ohne (WT) oder mit (WT + LDL) Hühnereigelb LDLs grafisch als Prozentsatz der Gesamtmenge an PG-Fettsäuren dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Fettsäureprofil von S. aureus in Gegenwart von Hühnereigelb LDLs kultiviert. Wir verwendeten eine unvoreingenommene lipidomische Analyse unter Verwendung von hochauflösenden/genauen MS und MS/MS, um das Fettsäureprofil von S. aureus PG zu bestimmen. S. aureus wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von Hühnereigelb LDLs inkubiert, und das PG-Profil dieser Zellen wurde mit denen von Zellen in 1% Tryptonbrühe kultiviert verglichen.

Die Autoren haben keine Angaben.